[发明专利]一种高纯度心肌细胞原代培养方法

权利要求书

1.一种高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、将离体的乳鼠心脏转入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿中，将心脏剪成组织碎片；

(2)、将组织碎片转入EP管中，加入酶消化液，所述的酶消化液由Ⅱ-型胶原酶、胰蛋白酶以及PBS缓冲液组成，酶消化液中Ⅱ-型胶原酶的质量百分比浓度为0.04％，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.09％；

(3)、将EP管置于35～40℃水浴条件中进行第一次消化，消化时间为6～10分钟，消化完毕后吸取上清液后并弃去；

(4)、将EP管继续置于35～40℃水浴条件中，继续加入酶消化液进行后续消化，消化时间为10～12分钟，消化完毕后吸取上清液后并将上清液放置于离心管中，所述离心管中预先放置了含有胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，离心管置于冰上；

(5)、重复步骤(4)，循环提取上清液，直至EP管中的组织碎片变白并变小后，完成上清液的收集，离心管中所收集的上清液即为心肌细胞悬液；

(6)、将收集好的心肌细胞悬液离心并除去上清，再加入DMEM/F12完全培养基，进行心肌细胞重悬，制得心肌细胞重悬液；

(7)、然后将心肌细胞接种在培养皿A中进行差时贴壁1～1.5h；

(8)、吸取培养皿A中的心肌细胞悬液到培养皿B中，清洗培养皿A中沉于皿底但未贴壁的心肌细胞并重悬，然后转入到培养皿B中进行培养。

2.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(3)中在第一次消化时摇晃EP管，并取出EP管弹2-10次，弹完后立刻水浴加热。

3.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(4)中在消化时摇晃EP管，每隔3min取出EP管并弹2-10次，弹完后立刻放入水浴加热。

4.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(6)中以1000rpm转速离心8min。

5.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(7)中进行差时贴壁前先将心肌细胞重悬液经细胞40μm滤网过滤，滤去细胞团块，用DMEM/F12完全培养基冲洗离心管和滤网。

6.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(8)中所述培养皿B在接种前用0.1％明胶包被，并开启紫外灯照射30min。

7.根据权利要求1所述的高纯度心肌细胞原代培养方法，其特征在于：步骤(8)的培养过程中，将每个培养皿B均按照前后左右方向摇晃以分散细胞。