[发明专利]基于鲎试剂细菌内毒素及(1-3)-β-D葡聚糖检测的微流控芯片

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及基于鲎试剂细菌内毒素及(1-3)-β-D葡聚糖检测的微流控芯片。

背景技术

近年来，随着抗生素的大量滥用和免疫抑制剂在临床的广泛使用，侵袭性深部真菌感染的发病率和病死率越来越高。其中，曲霉、隐球菌以及念珠菌已经逐渐成为临床上几种重要的致病真菌。(1-3)-β-D葡聚糖是许多真菌如念珠菌、曲霉、镰刀菌等细胞壁的多聚糖组分，不存在于细菌、病毒和人类细胞中，在人体液、血液和组织中能被检测，是一种真菌广谱循环标志物。因此，(1-3)-β-D葡聚糖可用于念珠菌病及曲霉菌病的早期检测诊断。同时，细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，重症疾病的感染程度以及全身炎症反应水平的标志物，病人病情的恶化往往伴随着内毒素含量的增加，病情的缓解也常伴随着内毒素含量的减少。因此快速检测血液、脏器内毒素含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参考。

目前侵袭性细菌与真菌感染检测具有以下弊端：实验周期较长、检测率较低、消耗样本与试剂量大、检测设备复杂、成本高、需要专业检测人员进行操作。同时，该检测对环境的要求极其苛刻，试验中任何人为的操作都可能引起结果的偏差。微流控芯片，由于所操控的试剂与样本的体积很小(约10^-9～10^-18L)，在提高检测反应速率的同时，让人为因素对检测过程的影响减小到最低，与外部环境接触极少，可极好的规避传统检测的弊端。

基于鲎试剂的内毒素与真菌(1-3)-β-D葡聚糖的检测原理如下：脂多糖能特异性激活鲎试剂中的C因子，活化的C因子激活B因子，活化的B因子进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的pNA(对硝基苯胺)从而引起吸光度的变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对内毒素浓度进行定量。真菌(1-3)-β-D葡聚糖能特异性地激活鲎试剂中的G因子，进而激活凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的pNA(对硝基苯胺)从而引起吸光度变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对真菌(1-3)-β-D葡聚糖浓度进行定量。可见，基于鲎试剂检测内毒素与葡聚糖的基本过程基本相同，芯片可以采用相同的设计。

发明内容

本发明公开了一种基于鲎试剂细菌内毒素及(1-3)-β-D葡聚糖检测的微流控芯片，包括并行设置的样品处理路线和试剂处理路线，该两条路线均与反应检测区连接，所述样品处理路线包括顺次连接的进样过滤区、存储区I和混合区II，所述试剂处理路线包括顺次连接的存储区II、存储区III和混合区I，所述混合区I和混合区II分别与所述反应检测区连接；

还设有废液区，所述废液区与所述反应检测区连接；

所述存储区II与存储区III间设有常闭微阀，所述存储区II与所述常闭微阀均被一柔性薄膜分为上下两层结构，所述下层区域为走液体区，所述上层结构为走空气区，位于所述存储区II内下层区域的液体在压力作用下进入常闭微阀的下层区域，并继而进入所述存储区III。

进一步，所述常闭微阀为单向阀结构，包括位于所述上层区域的第三腔室及位于所述下层区域的挡片，所述柔性薄膜位于所述第三腔室及所述挡片间。

进一步，所述存储区II包括弹性帽部、位于所述弹性帽部下方的第二腔室，所述弹性帽部与所述第二腔室间形成第一腔室，所述第二腔室及所述第一腔室均位于所述上层区域内，所述第二腔室的顶部设有与所述第一腔室连通的通孔。

进一步，所述混合区I和混合区II均为弯道结构。

进一步，还设有平衡气压管，所述平衡气压管的两端分别与所述进样过滤区和所述废液区连接。

进一步，所述柔性薄膜为PDMS薄膜。

进一步，所述混合区I与所述反应检测区间设有防倒吸缓冲球，所述混合区II与所述反应检测区间设有防倒吸缓冲球，所述反应检测区与所述废液区间设有防倒吸缓冲球。

进一步，平衡气压管两侧均设有防倒吸缓冲球。

本设计的微流控芯片为一次性使用芯片。该芯片的使用过程及材质选择说明如下：首先，由于G试验对环境中的细菌非常敏感，而且被杀死的细菌表面的葡聚糖仍会影响检验结果，需要利用热碱性溶液(KOH与KCl的混合溶液)对芯片进行杀菌降解。其次，最终的检测利用的是溶液的吸光度，因此，所选材料应具有耐碱性，高透光度，低成本易大批量生产等特性，如塑料、PMMA(耐碱类)等材料。另外，对于存储区II以及微阀门的制作，所采用的中间层为弹性薄膜，可使用PDMS等材料。