[发明专利]一种特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，RNA分子通过破坏特定的mRNA，以抑制某种基因表达的生物学过程。该技术具有以下几点优势：1高效性；2特异性；3位置效应；4高稳定性；5可传播性；6浓度时间依赖性。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM)：是源自于黑色素细胞的一种恶性肿瘤，好发于皮肤，恶性程度高，治疗难度大。虽然黑素瘤仅占全部皮肤肿瘤的4％,但却占皮肤肿瘤死亡人数的80％,是皮肤肿瘤中死亡率最高的一种恶性肿瘤。美国国家癌症研究所(NCI)的数据显示，在2003-2007年间，患病人数为每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估计有68130个患者被诊断患有黑色素瘤，其中8700个患者将因此丧生(http://www.cancer.gov/)。恶性黑色素瘤的发生率在全世界范围内正在不断地上升，包括以前发病率低的地区，它已成为一种严重威胁人们健康的恶性疾病。在中国黑色素瘤患者有逐年增高的趋势。北京市八城区统计资料显示，2000年MM发病率为0.2例/10万，到了2004年已达1例/10万。根据中国临床肿瘤协会(CSCO)黑色素瘤专家委员会发表的《中国黑色素瘤诊治指南(2011版)》，我国每年新发病例约2万例，已经成为了严重危及我国人民健康的疾病之一。

Twist1是属于b螺旋-环-螺旋家族的转录因子，位于7q21.2，包含2个外显子和1个内含子。该转录因子的分子量约为21kDa。Twist1的b螺旋-环-螺旋结构域在人类，小鼠，蛙，果蝇等很多物种中高度保守。Twist1蛋白中¹⁰⁹Q-T¹²¹是最主要的结构域，负责结合DNA。该基因主要在中胚层来源的组织中表达。在人体正常组织中，Twist1在胎盘，心肌和骨骼肌等组织中高表达，在胰腺，肾脏等组织中低表达，而在脑(外胚层来源)，肺和肝(内胚层来源)的组织中不表达。Twist1可以调控很多下游靶基因，通过这种方式，来参与控制各种各样的生物学进程和信号通路件，例如FGF信号通路，SHH信号通路，以及TGFβ信号通路等。

除了在正常组织中发挥作用，Twist1还与包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胃癌，膀胱癌，食道鳞状细胞癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤密切相关。在这些肿瘤中，Twist1可以在肿瘤发生，发展和转移中扮演多种角色。特别是可以阻碍肿瘤诱导的细胞衰老和凋亡，增强肿瘤干细胞群体，并且可以帮助癌细胞侵袭和转移，以及上皮-间叶转化(EMT)。其中EMT是肿瘤细胞发生转移的第一个步骤。近来发现，乳腺癌、恶性黑色素瘤以及其他肿瘤中Twist过表达可作为预后不良的一个指标，许多证据表明Twist1蛋白也参与调节细胞凋亡。在人类肿瘤中Twist1活化可能具有非常重要的临床意义，Twist1很可能作为指导诊断、判断预后的指标，并可作为肿瘤生物治疗的一个新靶点。

下调TWIST1的表达，可以有效降低肿瘤抵抗衰老和凋亡的能力，抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA(siRNA)及其应用。

本发明根据RNAi发生原理，设计并合成了针对TWIST1基因的小干扰RNA，其GC含量为52.63％，且正义链和反义链的长度均为19nt。

进一步地，本发明的小干扰RNA双连体分子的正义链和反义链序列分别为：

正义链：5’CCGGAGACCUAGAUGUCAUdTdT-3’，(SEQIDNO.1)

反义链：5’-TdTdGGCCUCUGGAUCUACAGUA-3’(SEQIDNO.2)。

本发明提供的上述小干扰RNA，能够特异性下调细胞或生物体中TWIST1基因的表达量。

进一步地，本发明的小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为：5’-CCGGAGACCTAGATGTCAT-3’(SEQIDNO.3)。