[发明专利]一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法

说明书

本发明公开了一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。其是将海洋生物加入裂解液与蛋白酶抑制剂后进行匀浆，离心，取上清液和沉淀物；将沉淀物进行低温破碎、超高速低温离心获取蛋白质提取液；再将蛋白质提取液进行两次丙酮沉淀，对蛋白质组样品纯化，再经还原、烷基化，从海洋生物组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组学样品。本发明工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行了特别优化，对开展海洋蛋白质组学的相关研究具有较大意义。

技术领域

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，尤其是一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。

背景技术

蛋白质组学是在90年代初期，由Marc Wikins和学者们首先提出的新名词，本质上指的是是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。更重要的是，基因组是相当稳定的实体，而蛋白质组通过与基因组的相互作用而不断发生着改变。一个生命体在其机体的不同部分以及生命周期的不同阶段，其蛋白表达可能存在巨大的差异。一个生命体在其整个生命周期中所拥有的蛋白质的全体，或者在更小的规模上，特定类型的细胞在经历特定类型刺激时所拥有的蛋白质的全体，分别被称为这个生命体或细胞类型的蛋白质组。随着人类基因组草图的完成，现在许多学者开始探索基因与蛋白质如何通过相互作用来形成其它蛋白质。

现有蛋白质组学研究大多数是对陆地生物进行的，少有海洋生物的研究报道。而海洋生物由于其特殊的生存环境，蛋白质的复杂性和耐受性与陆地生物不同，导致目前使用蛋白质组学研究的通用处理办法在对海洋生物进行蛋白质组学研究过程中，通常伴随着蛋白质组的变性，活性丧失和蛋白回收率低下。因此，研发一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作可靠、制备科学、蛋白质破坏小及回收率高的用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取海洋生物于离心管中，加入裂解液，料液比1︰2～5(m/v)，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为0.5～1.2mM，用组织匀浆器充分打散后，离心，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行低温破碎，离心，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后在合并的上清液中加入其体积4～6倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀2～4h，离心，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积3～5倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀1～2h，离心，收集沉淀；按上述步骤重复操作1～2次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰2～5(m/v)，室温作用2～4h；离心，取上清液；上清液再次离心，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；