[发明专利]一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法

权利要求书

1.一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取海洋生物于离心管中，加入裂解液，料液比1︰2～5m/v，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为0.5～1.2mM，用组织匀浆器充分打散后，离心，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性蛋白溶液；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行低温破碎，离心，收集上清液，得到组织细胞膜蛋白的提取液；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后在合并的上清液中加入其体积4～6倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀2～4h，离心，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积3～5倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀1～2h，离心，收集沉淀；按上述步骤重复操作1～2次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰2～5m/v，室温作用2～4h；离心，取上清液；上清液再次离心，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；

(6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积3～4倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L 的DTT至终浓度为3～4mmol/L，室温孵育30～50min；然后再加入0.5mol/L 碘乙酰胺至终浓度为55～90mmol/L，室温避光孵育20～50min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗1～3次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。

2.根据权利要求1所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的海洋生物为马尾藻、裙带菜或紫菜。

3.根据权利要求1所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的步骤(1)、步骤(5)中的裂解液的配方为：50mM Tris-HCl pH7.4、150mMNaCl、1%NP-40和0.1%SDS混合制成或为市售裂解液RLT Buffer。

4.根据权利要求1所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的蛋白酶抑制剂为PMSF或Cocktail。

5.根据权利要求1所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的Tris-Hcl缓冲液的配方为：50mM Tris-HCL、1mM EGTA和1mMPMSF混合制成，调节pH值为7.4。

6.根据权利要求1所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的低温破碎为液氮研磨破碎或置于冰盒上，超声破碎。

7.根据权利要求6所述的一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：所述的超声破碎是控制超声破碎仪功率50～100w，超声0.8s，关闭0.8s，超声破碎时间1～5min。