[发明专利]一种薄荷多倍性的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种薄荷（MenthahaplocalyxBriq.）多倍性的鉴定方法。

背景技术

薄荷（MenthahaplocalyxBriq.）为唇形科薄荷属多年生草本植物，全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等等，其茎、叶中所含的挥发油被广泛地应用于食品、医药、化妆品、香料、烟草等工业。中国是世界公认的薄荷主产国，江苏省为薄荷的道地产区，但长年栽培的很多品种都出现了严重退化，鲜草和薄荷油产量下降的情况。多倍体有很多二倍体所没有的优势性状，如植株的巨大性、抗性增加、有机合成速率加快及克服远源杂交不育性。发展薄荷的多倍体育种技术有利于薄荷优良品种的选育。然而，薄荷是传统中药，栽培历史悠久，经过多年的人工选育和自然选择其遗传背景已经相当复杂，在进行多倍体育种前需要先摸清加倍实验材料的倍性基础。

传统的倍性鉴定方法包括形态鉴定法，多倍体具有生长缓慢，发育迟缓，花期推后等特性。因此，整个生长期均可以外部形态特征来判断，这是初步鉴定是否为多倍体的最简单、最直观的方法。但无法准确鉴定具体倍性。细胞学鉴定法，例如对植株花粉母细胞的染色体数目进行技术观察，由于薄荷具有唇形科植物特征的轮伞花序，花小进行花粉母细胞的培养非常困难因此也不易使用。流式细胞分析仪测定法是目前最快速且有效的鉴定细胞倍性的方法而。但其原理是根据DNA含量测定，再通过比较DNA含量来推断细胞的倍性。因此需要首先明确对照植株倍性才能比较出检测株系倍性。通过检测分生旺盛的器官、组织的染色体数目来进行鉴定，这是最直接、最准确的一种鉴定法。这种方法切实可行，广泛应用于倍性鉴定。但这一方法也往往因取材、观察视野和技术误差等因素影响结果的准确性。利用该方法进行倍性研究前需要对所取分裂旺盛部位进行预实验和观察对分裂时期有所把握才能完成鉴定。作者曾利用不定根尖压片方法进行过薄荷属植物染色体观察研究（薄荷属植物染色体观察，江苏农业科学，2009年第4期，190页）但经过观察该方法所得到的具有有丝分裂相细胞少，处于分裂中期可用于染色体观察的细胞数目更难发现，并且根尖细胞结构致密，分散难度大，解离后敲片时间长技术难度高不易于掌握和大量样本的分析。

发明内容

本发明针对传统现有技术的不足之处，提供了一种薄荷多倍性鉴定的方法为了该植物倍性育种提供技术支持。

为了达到上述目的，本发明提供了一种薄荷多倍性鉴定的方法，包括如下步骤：

（1）分生组织准备：

选取当年生植株叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒；切取0.5×0.5cm大小，将其接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为18-24℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常培养15-20d；所述正常培养条件为：温度18-24℃，光照强度为1600-2000lx光照时间为8-10h/d，；所述诱导培养基为MS培养基并添加激素2,4-D和KT；所述诱导培养基中2,4-D浓度为1.0-6.0mg/L，KT浓度为0.5-1.0mg/L；将得到的薄荷叶片切口边缘愈伤组织切割后接入继代增殖培养基中进行继代培养25-35d，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16h/d，光照强度为1600-2000lx；所述继代增殖培养基为MS培养基并添加激素2,4-D和KT；所述继代增殖培养基中2,4-D浓度为2.0-4.0mg/L，KT浓度为1.0-2.0mg/L；

（2）分生组织的处理：取步骤（1）中增殖旺盛的愈伤组织，切割后浸泡于含有0.1-0.2%秋水仙素溶液中2-6h后取出，蒸馏水清洗表面溶液后用乙醇-冰醋酸浓度比（3:1）固定液固定24h后取出蒸馏水清洗表面溶液；充分清洗至无味后用2.5%混合酶液酶解室温下2-4h；蒸馏水洗去酶液后于新鲜蒸馏水中浸泡30min；

（3）分生组织细胞压片：取步骤（2）中处理后的愈伤组织于载玻片上用镊子将其压碎，去除大块残碎材料，加入改良的苯酚品红溶液染色后将载玻片在酒精灯上加热，染色完成后用45%醋酸溶液分色，加上盖玻片后用镊子轻敲盖片使细胞分散均匀；

上述诱导培养基、继代增殖培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值为5.6-5.8。