[发明专利]分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法

说明书

本发明公开了分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。所述灌洗液包含青‑链霉素双抗、酚妥拉明、维生素C和PBS。所述酶解液包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、1×肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z‑VAD‑FMK。所述方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注灌洗液，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得胎盘造血干细胞。本发明显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量高、存活率高，细胞污染率极低。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。

背景技术

造血干细胞(Hemopoietic Stem cell，HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源。

随着研究的日渐深入，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，HSC的主要来源是骨髓、外周血及脐血，骨髓和外周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而脐血HSC数量有限，这些限制因素使其不能满足日渐增长的HSC临床应用需求。近年来，国内外学者研究发现，胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。胎儿出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8～10倍，可供其自用几次，甚至可提供给多个成人患者进行治疗。

此外，胎盘中提取的造血干细胞不但具有含量丰富、移植后排斥反应低、无伦理障碍等优点，还有以下优点：胎盘中的造血干细胞更为早期，增殖能力强；胎盘众多的造血干细胞还可用来大规模制备红细胞和巨核细胞/血小板，用来替代输血。鉴于胎盘造血干细胞的这些优点，胎盘组织造血干细胞库技术的开展是干细胞研究领域的一大进展，将有效解决移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植治疗恶性血液系统疾病。

目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械酶解法。尽管机械酶解法能获取数量充足的细胞，但杂细胞含量高、造血干细胞含量较低，造血干细胞活率低。此外，现有技术中主要是对胎盘绒毛膜部位进行酶解消化，消化组织体积大，需要用大量的酶解液，生产成本高；整个提取过程操作繁复、耗时长，提取的细胞数量波动性较大、污染几率大大增加，不利于工业化。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。

分离胎盘造血干细胞的灌洗液，包含缓冲液、双抗、血管扩张剂和抗氧化剂。

优选地，所述分离胎盘造血干细胞的灌洗液包含PBS、青-链霉素双抗、酚妥拉明和维生素C。

更优选地，所述灌洗液中各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗，0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C。

分离胎盘造血干细胞的酶解液，包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、血管扩张剂、抗氧化剂和抗凋亡试剂。

优选地，分离胎盘造血干细胞的酶解液包含RPMI-1640培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK(Caspase抑制剂)。

优选地，所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.01～0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.01～0.05mg/mL胰酶、10～50U/mL肝素钠、0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C、5～20ng/mL Z-VAD-FMK。