[发明专利]山羊RanBP9基因克隆及在精子中的定位检测方法

权利要求书

1.山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）基因克隆及其在精子中的定位检测方法，其特征在于按以下步骤进行：

一、RT-PCR克隆山羊的RanBP9基因；

二、Q-PCR检测RanBP9mRNA在山羊睾丸、附睾组织中的相对表达量；

三、制备山羊睾丸、附睾组织切片；组织免疫荧光技术检测RanBP9蛋白在山羊睾丸、附睾组织中的表达；

四、精子细胞免疫荧光技术研究RanBP9蛋白在精子中的定位。

2.权利要求1所述的山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）基因克隆及其在精子中的定位检测方法，其特征在于步骤一中的RT-PCR模板是山羊睾丸组织提取RNA，设计特异引物和扩增方法。

3.权利要求1所述的山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）及其在精子中的定位，其特征在于步骤四中进行组织免疫荧光实验，采用改进的细胞离心管免疫荧光法，按以下步骤进行：

（1）采用假阴道法采集成年山羊的精液，进行精液品质鉴定；

（2）取50μl精液于1.5ml离心管中，加入950μl生理盐水，于4℃1000rpm离心5min，重复一次；吸去生理盐水，以4℃PBS重悬细胞；

（3）离心吸去PBS，以1ml4%PFA固定重悬精子，置于冰上固定30min；

（4）离心吸去固定液，用1.5ml4℃PBS重悬精子，放置5min后，用PBS再次洗涤精子；

（5）离心吸去PBS，重悬精子于一抗中，置于4℃温育1h；

（6）离心吸去PBS，以二抗重悬精子，4℃温育1h；用4℃PBS稀释精子和抗体至1.5ml；离心吸去PBS，以4℃PBS重悬精子，重复一次；

（7）暗处离心，以少量PBS重悬，将适量的精子细胞悬液滴于多聚赖氨酸覆层的载玻片上，加盖玻片，马上使用荧光显微镜观察拍照。