[发明专利]一种从d-生物素中分离杂质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂质的分离方法，具体指从d-生物素中分离富集杂质，旨在通过设计合理方案，使生物素中杂质进一步增长，再通过制备色谱分离技术富集和分离杂质。

背景技术

d-生物素又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。

根据欧洲药典标准，d-生物素中的已知杂质共有8个。事实上在生物素粗品中还存在一个明显的未知杂质，按照美国药典的液相分析方法，这个杂质的保留时间为RT＝2.36-2.59min。根据对生物素粗品以及氧化后分离的杂质的质谱分析，这个杂质的分子量为261，不同于已知8个杂质的分子量，因此本发明把这个杂质视为未知杂质。对生物素粗品进行精制，发现无法有效去除这个未知杂质。由于生物素粗品中出现未知杂质，我们有必要对其进行提纯和分离，制备出高纯的杂质固体。以便于做进一步的杂质分子结构分析，并有利于制备工艺的改进优化。

通过文献调研，未发现有d-生物素微量未知杂质提纯分离的相关技术报道，为解决此技术问题，本发明设计了一种从d-生物素中分离提纯微量未知杂质的技术方案，分离得到的杂质的纯度满足用于分子结构确证使用。

发明内容

本发明旨在从d-生物素中分离存在的微量的未知前述杂质，得到高纯度的杂质晶体，为进一步确认其分子结构，完善d-生物素杂质谱奠定基础，并有利于指导d-生物素制备工艺的优化。

本发明采以下技术方案：

一种从d-生物素中分离杂质的方法，包括以下步骤：

1)将d-生物素用双氧水氧化破坏；

2)通过制备色谱仪分离富集；

3)浓缩、烘干。

具体地，上述从d-生物素中分离杂质的方法，包括以下步骤：

1)将d-生物素用双氧水氧化破坏，得氧化后的生物素水溶液；

2)将步骤1)所得氧化后的生物素水溶液经制备色谱仪分离富集得到含此未知杂质的收集液；

3)将步骤2)所得含此未知杂质的收集液进行浓缩、烘干，得到杂质固体粉末。

上述从d-生物素中分离杂质的方法，其中：

优选地，所述双氧水质量浓度为5％-10％；

优选地，所述双氧水氧化反应时间为24-36h，双氧水氧化反应温度20-40℃；

优选地，所述制备色谱仪型号为CombiFlashRf+，分离柱型号为C1886g；

优选地，所述分离条件：流动相为1％磷酸氢钠水溶液∶乙腈＝70:30，流速20ml/min；

优选地，所述浓缩为真空浓缩；例如用旋转蒸发仪；

优选地，所述浓缩温度为60-75℃，真空度≤-0.08Mpa；

优选地，所述烘干温度50-60℃；进一步优选为鼓风烘干。

本发明所述d-生物素是指d-生物素粗品或成品。

优选地，所述d-生物素粗品其主成分含量为96.0％以上，进一步优选98.0％-98.5％。

本发明所述未知杂质定义如下：

按照美国药典(USP35-NF30P5918-5919)对d-生物素的液相分析方法，保留时间为RT＝2.36-2.59min的杂质定义为未知杂质，其分子量为261。

d-生物素在水中、高温中稳定，不易降解。本发明将d-生物素在双氧水中氧化后，其降解明显，而生物素主峰之前的未知杂质峰明显增加，说明d-生物素经氧化后此未知杂质的含量显著提升，有利于此未知杂质的分离。

本发明还包括按上述方法制备得到的未知杂质在d-生物素质量控制中的应用。本发明所述方法制备得到的所述未知杂质纯度高，可作为标准品用于d-生物素的纯度检测和质量控制。

本发明具有以下优点：本发明以d-生物素为原料，经用双氧水氧化破坏、制备色谱分离富集、浓缩、烘干等步骤制备得到d-生物素未知杂质。

根据本发明制备的未知杂质可用于d-生物素成品检测分析中的杂质标准品，以达到有效控制成品质量；并有利于指导d-生物素制备工艺的优化。本发明原料易得，操作简单，杂质的HPLC纯度≥96.5％，产品收率≥88％(以生物素粗品氧化后杂质的含量计)。

附图说明

图1为实验例1中d-生物素粗品的HPLC图。

图2为实验例1中d-生物素氧化后分离纯化后的未知杂质(即实施例1样品)的HPLC谱图。

图3为实验例1中d-生物素粗品的质谱图。