[发明专利]一种快速检测腈水解酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学分析领域，涉及一种腈水解酶，具体来说是一种快速检测腈水解酶 活性的方法。

背景技术

腈水解酶是一类非常重要的水解酶，它可直接将腈类物质水解为羧酸或胺，参与多种生 物体内重要物质的生物合成。此外，腈水解酶可作为一种生物催化剂，在羧酸及其衍生物的 不对称合成中占有重要的作用。

过去几十年中，许多测定腈水解酶活性的方法被开发出来，包括高效液相色谱法﹑气相 色谱法和毛细管电泳等。但这些方法操作过程复杂，而且耗时较长(ApplEnvironMicrobiol, 2007,73(19):6053-6057)。在筛选腈水解酶的传统方法中，薄板层析法方法简单快速，但 是通量较低(IntJBiochem,1985,17(6):677-683)。DeSantis等报道一种金属基方法能 检测浓度小于5.0mM的产物，然而这种方法不能应用于含有蛋白质等复杂体系中腈水解酶活 力的测定(JAmChemSoc,2002,124(31):9024-9025)。Santoshkumar等用平板法测定 产酶菌株催化脂肪族腈反应中释放出氨所导致的pH变化，由于体系中有缓冲溶液，反应中生 成的弱酸或弱碱对pH变化影响小，因此该检测方法的灵敏性有待提高(JIndMicrobiol Biotechnol,2010,37(1):111-115)。He等人在高氯酸羟胺和DCC存在条件下,用高氯酸铁 作为显色剂，测定了有机酸含量。然而，高氯酸羟胺在市场上很难买到，需要自己制备合成， 其制备过程繁琐，安全性低，而且高氯酸铁价格昂贵(ApplMicrobiolBiotechnol.2011,89 (3),817-823.)。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方法，所 述的这种快速检测腈水解酶活性的方法解决了现有技术中检测腈水解酶活性的方法通量低、 灵敏度不高的技术问题。

本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方法，首先利用腈水解酶催化腈类化合物发 生水解反应，水解产物经终止反应、稀释后，加入含有盐酸羟胺和二环己基碳二亚胺(DCC) 的乙醇溶液，震荡混均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，用紫外分光 光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。

进一步的，所述的腈类化合物为扁桃腈、烟腈、苯甲腈、1-氰基-环己基乙腈或乙腈。结 构式如下所述：

本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：

1)一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤；采用磷酸盐缓冲溶液重新悬浮静 息细胞，然后加入底物腈，在摇床上转化反应；

2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤；将步骤1)的反应样品用甲醇终 止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4～6倍，即为转化反应后的样品；

a)向步骤2)所得的反应样品中加入三倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐酸 羟胺乙醇溶液的浓度为1～9mM，接着加入样品体积五分之一体积的DCC的乙醇溶 液，DCC的乙醇溶液的浓度为0.2M；将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范 围为20～80℃，加热10～40min，水浴完成后接着加入样品体积二十分之一体积 的三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1～1.0 M，显色反应10min，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度 值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。

进一步的，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为4mM。

进一步的，所述的恒温加热条件为60℃。

进一步的，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.5M。

本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：

1)一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤；采用0.1M的磷酸盐缓冲溶液重 新悬浮静息细胞，使得静息细胞的浓度为10g/L，然后加入底物腈，使得底物腈 的终浓度为50mM，然后在摇床上转化反应；

2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤；将步骤1)的反应样品用甲醇终 止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4～6倍，即为转化反应后的样品；