[发明专利]一种抗牙周病抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体是一种牙周病抗体的制备方法。

背景技术

对于口腔疾病，人们想到最多的就是龋齿。然而最新的一项调查显示，目前在发展中国家，牙周病的发病率已经超过龋齿的发病率，高达75%以上。而牙周病主要的致病菌，被公认为是牙龈卟啉单胞菌。目前对牙龈卟啉单胞菌进行被动免疫的措施是,将单一的或混合的牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白作抗原，免疫马牛羊兔等哺乳类动物，从动物血清中提取抗体，进行被动免疫防治。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗牙周病菌抗体IgG的制备方法，使抗体的生产成本降低，抗体效价提高。本发明的另一目的，是抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG的应用。提供以本发明制备的抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG和抗菌剂作为被动免疫有效成份用于预防牙周病的发生。

采用的技术方案是：

1、一种抗牙周病菌抗体的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）取牙龈卟啉单胞菌，在BHI培养基中厌氧培养5-7天；将培养好的牙龈卟啉单胞菌进行离心处理，收集菌体，用pH6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗涤菌体4-6次，50-65℃的温度下，加热25-35分钟，进行灭活处理，得到牙龈卟啉单胞菌液；

将牙龈卟啉单胞菌液和等量的福氏佐剂混合，用高速匀浆器处理，制得菌体佐剂抗原；

（2）、根据脯乳类动物种类，每次取牙龈卟啉单胞菌抗原1-5ml，对动物进行淋巴结和背部皮下多点注射，共注射三次，每次间隔三周；末次免疫后20天，经检测效价合格后采集血清，取免疫血清搅拌下加入适量盐水稀释，调节pH值至7.5-8.5，加入等量饱和硫酸铵溶液，在2-8℃温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟，取其沉淀，经复融超滤浓缩除盐、除菌后冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG粗提物；

（3）、将抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG粗提物离心纯化后，再经DEAE-SephadexA50层析柱纯化；用含NaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml；

将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经SephadexG200凝胶柱层析纯化，用含NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集有抗体活性的蛋白洗脱液，经0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。

上述离心纯化的速度为5000-12500rpm，离心次数2-5次，DEAE阴离子交换层析法中，洗脱液磷酸缓冲液的浓度为0.003-0.02M，所含NaCl的浓度为0.03-0.1M，凝胶过滤柱层析洗脱液磷酸缓冲液浓度为0.01-0.2M，所含NaCl的浓度为0.1-0.5M；亲和层析洗脱液浓度为0.1-0.5M。

上述牙龈卟啉单细胞，用BHI培养基，在37℃温度厌氧条件下，静置培养牙龈卟啉单胞菌5-7天，将培养后的牙龈卟啉单胞菌用4000rpm离心10分钟，收集菌体；用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体5次，50℃、25分钟加热灭活处理，制得牙龈卟啉单胞菌液。取菌液（20亿/ml），与等量的福氏佐剂混合，用高速匀浆器处理，制得牙龈卟啉单胞菌佐剂抗原。

根据哺乳动物种类，每次取菌体佐剂抗原1-5ml，对动物进行淋巴结和皮下多点注射，共注射三次，每次间隔三周；

第三次免疫动物后20天，检测效价合格后，收集抗血清用盐水稀释，调节pH值至8.0，搅拌下加入等量饱和硫酸铵溶液置2-8℃静置24小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，经超滤除盐、浓缩、除菌后冷冻干燥，制得抗牙周病菌抗体IgG粗提物；

将抗牙周病菌抗体IgG粗提物经DEAE-SephadexA50层析柱层析；柱床2.5×35cm，加入10mg/ml的样3.0ml，用含0.07MNaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速20ml/h，洗脱液按每管5.0ml；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml；继而将该液进一步经SephadexG200凝胶柱层析；柱床2.0×65cm，加样1.5ml，用含0.1MNaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速8.0ml/h，洗脱液按每管5.0ml，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集有抗体活性的蛋白洗脱液，经0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗牙龈卟啉单胞菌抗体IgG纯品。