[发明专利]瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针

权利要求书

1.瓜上10种病害的微阵列芯片，其特征是：所述芯片包含如下寡核苷酸探针中的至少一类；

瓜蔓枯病菌Db-Px：CCATTGTAAGCCGCTGTTGTTGAGAAGTGAAA；

甜瓜黑点根腐病菌Mc-Px：CCACAACTACAGGGTAGCTACCGGGTAGGCTACTCTAGAGT；

瓜炭疽病菌T-GAPDHx：CGTAATGCCAGAGATCCCGGGAAGAGGA；

瓜炭疽病菌T-GSx：CTGACAGAACTGGACCAGACGTGCAATACCC；

瓜细菌性果斑病菌aac-Px：AAGAGGATCGTTCGAGAGAAGCGGCCTTC；

黄瓜黑色根腐病菌Phs-Px：CATCAGGTTGTTTTGTCGGGTGTGTGTGTG；

黄瓜黑星病菌Cc-Px：TGTCCAGCGTGTGGTGGAGGGTG；

瓜细菌性角斑病菌Psl-px：GCCATGCCGGTGAGTTTGCCTGC；

黄瓜花叶病毒CMV-Px：AGCGGGACGCGGAAGAACTCCCG；

南瓜花叶病毒SqMV-Px：GAACTGGGAAAGAAGCCACAACAAAACCCAGA；

黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px：GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。

2.利用权利要求1所述的芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法，其特征是：

对每个待测样品依次进行以下步骤：

1)、提取待测样品的DNA；配置成浓度为5-20ng/μl作为模板；

2)、引物荧光标记PCR反应：

反应体系25μl：10×PCRBuffer2.5μl，25mMMgCl₂2.5μl，dNTP0.5μl，10μM上下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl，模板1.0μl；

PCR反应程序：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；

上下游引物分别为以下：

瓜蔓枯病菌Db-3x：CGTAAGTAGACCTCCACCAC

Db-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；

甜瓜黑点根腐病菌Mc-1x：CATTAAAGAGTTATCCAACTCC

Mc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；

瓜炭疽病菌GAPDH-3x：CCCTTCATTGAGACCAAGT

GAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；

瓜炭疽病菌GS-3x：TTCGTTCTCGAACACGAT；

GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；

瓜细菌性果斑病菌aac-1x：CTGGGAGCGATCTTCATC

aac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；

黄瓜黑色根腐病菌Phs-1x：CAACCACTCCCTCCCTT；

Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；

黄瓜黑星病菌Cc-3x：ATCGAGAAGTTCGAGAAGG；

Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；

瓜细菌性角斑病菌Psl-1x：GGCGACGCAATCAATGAT；

Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；

黄瓜花叶病毒CMV-1x：TCCGAGGAATTAAATGTTGA；

CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；

南瓜花叶病毒SqMV-1x：ACTTTGAAGTGGCTGGAAA；

SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；

黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-1x：CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG；

Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；

3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；

4)、芯片杂交与洗涤：

将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物或者将步骤3)所得的混合物95℃变性5min，然后冰浴5min；得预处理后PCR扩增产物；

然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45℃杂交1h；

5)、芯片扫描，获得检测结果。