[发明专利]一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变，得到了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬酰胺酶相比，本发明的突变体的胞外分泌能力提高了3.14倍。本发明构建的重组菌，发酵生产天冬酰胺酶酶活达到407.6U/mL，生产率达到9.26U/(mL/h)，为目前报道的最高的产量。

技术领域

本发明涉及一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。

L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。

如何在食品安全菌株中表达L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力，是目前亟待解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，以高效分泌信号肽菌株为基础，通过构建p43强启动子菌株，实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达，通过缺失N端残基，进一步提高天冬酰胺酶的表达强度，实现天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。

本发明的第一个目的是一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。

本研究中的突变体为使用了WapA外源信号肽的天冬酰胺酶的基础上做的改造，也就是在天然的(NCBI上公布的NC-000964.3)天冬酰胺酶的基础上先替换了信号肽，然后再次基础上对天冬酰胺酶N端进行的缺失。

本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK质粒为载体，表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为宿主构建的。

在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因的氨基酸序列是SEQ ID NO.1。

在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2。