[发明专利]高耐受细胞株的筛选方法

说明书

本申请是申请号为201210051119.2、申请日为2012年3月1日、发明名称为“高耐受细 胞株的筛选方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及生物工程技术，特别是适合于大规模生产用的高耐受细胞株的筛选和培养 方法。

背景技术

生物反应器在动物细胞规模化培养中的应用也是生物制药领域的发展趋势，很多生物 制药公司均致力于开发相关产品的发酵工艺，以满足公司产品能够在低成本大规模情况下 进行产品的制备。随着全球对生物制品的需求量的增大，生物反应器的规模也不断地提高。 此时，动物细胞大规模培养也就成了生物制药领域最重要的关键技术之一。

但是，在发酵规模不断放大的过程中，细胞生长的微环境发生了很大的变化，细胞生 长受到显著影响，甚至导致细胞死亡。当细胞高密度生长达到一定程度，由于其自身特性 不同，其工艺参数耐受情况也不尽相同。随着细胞密度的增长，主要底物氧化还原代谢加 剧，传质及传热过程需要进行调整，加大搅拌及提高通气量是最主要的手段，伴随而来的 是细胞不可避免的受到的一系列物理损伤。底物的大量消耗会导致副产物的大量产生，对 各类细胞有较高的毒性，同时，底物耗竭会造成细胞生长代谢停滞进而导致大量细胞快速 死亡。

因此，工艺参数是限制发酵规模的重要问题，各种工艺的开发依赖于细胞株能够耐受 微环境各项参数指标的变化，筛选获得能够在生物反应器中的高耐受细胞株显得尤为重 要。

采用高耐受细胞株，不仅能够实现细胞株在无血清、无蛋白或者化学成分限定培养基 中的生长代谢和产物表达，同时，还能大幅度的提高细胞株的生长代谢机能，增强细胞株 抵抗微环境的各种恶劣变化，以此实现控制细胞增殖水平、延长细胞培养周期，解决规模 化放大参数的限制、降低成本等目标，进而提高规模化培养的效能。

发明内容

本申请涉及适合于大规模生产用的高耐受细胞株的制备和筛选方法。

本申请的一方面提供了一种高耐受细胞株的筛选方法，包括：选取可生长细胞株，将 其进行体外培养，改变细胞培养条件从而迫使细胞在不良生长环境中生长代谢，进而筛选 获得适应于所述不良生长环境的高耐受细胞株，其特征在于，所述改变的细胞培养条件包 括：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度或搅拌速度，或所述细胞 培养条件的两种或两种以上的任意组合。

在一些实施方式中，本申请的高耐受细胞株的筛选方法包括改变两种或两种以上选自 以下组的细胞培养条件：细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及 搅拌速度。在一些实施方式中，可改变三种或三种以上所述的细胞培养条件。在一些实施 方式中，可改变四种或四种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变五种或 五种以上所述的细胞培养条件。在一些实施方式中，可改变六种或六种以上所述的细胞培 养条件。

如果通过改变或调整多种细胞培养条件来筛选高耐受细胞株，所述细胞培养条件可同 时改变或调整，也可分先后分别改变或调整，也可以有些培养条件同时改变，有些培养条 件单独改变。例如，在一些实施方式中，可同时改变细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨 浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度，将细胞进行培养，挑选出适应于改变后的培养条件 的高耐受细胞株。在一些实施方式中，在细胞培养过程中可以按预定的顺序依次改变培养 条件，比如先改变渗透压，再改变乳酸浓度，再改变氨浓度，再改变pH值，再改变溶氧 浓度，再改变搅拌速度等，又比如先改变渗透压，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨 浓度等，又比如先改变渗透压和pH值，再改变搅拌速度，再改变乳酸浓度和氨浓度等。 在一些实施方式中，在细胞培养过程中改变的细胞培养条件中至少有两种分别进行改变， 即不是同时改变。例如，在一些实施方式中，先改变初始细胞密度、渗透压、pH值和搅拌 速度，然后再改变乳酸浓度和氨浓度。