[发明专利]人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒

说明书

本发明提供一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物以及试剂盒，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针。本发明能够用于膀胱癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价等方面，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒

背景技术

膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。临床上膀胱癌具有恶性程度高、术后复发率高等特点，因此早期诊断对治疗和预防复发有着非常重要的意义，可以增加保留膀胱的机会并提高患者总体生存率。

众所周知，恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程。大量研究表明，有一套特定基因的改变导致并推动了癌症的发生发展：染色体不稳定性、微卫星不稳定性、表观遗传学改变等。表观遗传是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传给子代细胞的基因组修饰作用，目前最为人们所知的表观遗传学主要方式是DNA甲基化。由于DNA甲基化往往发生在膀胱癌发生过程中的早期，很容易在患者的尿液中检测到。因此，检测尿液中DNA甲基化状态有望成为膀胱癌早期无创诊断的一条新途径。

膀胱癌DNA分子甲基化检测组合物一直以来都没有其特有的基因，多数研究是联合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平，以此来提高灵敏度与特异性。根据最新的文献报道，研究人员已经通过大规模的基因筛选和样本测序，发现在膀胱癌发生早期尿液脱落细胞中1-2个基因的甲基化概率明显增加，这为膀胱癌早期辅助诊断提供了可靠的检测标志物。

TWIST1是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子，其mRNA在胎盘组织表达量最高，在胚胎发生、发展中发挥重要作用。它参与上皮间质转化过程的调控，进而影响肿瘤的侵袭与转移。转移性肿瘤中常见TWIST1过表达或启动子的甲基化。目前国内外涉及膀胱肿瘤与TWIST1基因的相关性研究包括，TWIST1蛋白表达与肿瘤的相关性分析，以及尿液标本甲基化水平检测。Isabelle Renard等人研究发现，在膀胱癌尿液样本中TWIST1甲基化的检出率达到88％，特异性达到94％。

Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复杂的基因表达模式，主要表达于胚胎组织和来源于间叶组织的成体细胞。越来越多的研究表明，Vimentin的表达不再是间充质起源细胞、向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志，它也在乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌等上皮源性恶性肿瘤中共同表达，而且与癌细胞的侵袭性强和易转移密切相关。另有研究证实，与肿瘤癌前病变(如腺瘤)产生相关的Vimentin的表达下调可能与其启动子的甲基化密切相关，这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin表达，其对于肿瘤细胞迁移具有促进作用。

目前，膀胱镜检查、对可疑病变组织进行活检以及对尿液进行细胞学检查仍然是膀胱肿瘤临床最常用的诊断和随访方法。然而，膀胱镜检查是一种侵入性且昂贵的检查方法，给患者带来痛苦及经济负担；尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，给临床应用带来不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的膀胱癌检测标志物以及试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针；