[发明专利]基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种食品安全领域的技术，具体是一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法。

背景技术

抗生素被广泛用于人类医疗以及动物养殖中，用于防病治病、提高饲料利用率和促进动物生长。四环素是一种常见的抗生素，具有良好的广谱抗菌性，被广泛应用于畜禽养殖。我国是世界上四环素类抗生素生产、销售大国，抗生素的使用不合理及滥用导致其在动物性食品和环境中的药物残留。目前，常见致病菌对四环素类耐药现象严重，对生态系统和人类健康构成严重威胁。因此，研究快速、简便、经济、可靠的四环素快速检测技术具有重要的现实意义。

传统的四环素测定方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法和液相色谱法。尽管这些方法灵敏度高，但传统的四环素检测方法存在的显著弊端是检测耗时长、常需要繁杂的前处理过程、较为昂贵的仪器设备以及专业的技术操作人员。因此，急需建立一种快速、准确且特异性高的四环素残留检测方法。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN104931553A，公开(公告)日2015.09.23，公开了一种基于丝网印刷电极的四环素适配体传感器制备及检测方法，将离子液和四氧化三铁逐层修饰到丝网印刷电极表面常温下静置至干燥，然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的丝网印刷电极表面。但该技术电极的修饰过程需要三个步骤，操作步骤越繁琐，影响因素越多，并且耗时也更长。再者，该技术实施过程中使用离子液体，用于制备离子液体的吡啶类原料是挥发性有机物，且离子液体的再生过程是采用具有挥发性的传统有机溶剂进行萃取的过程。已有研究表明，离子液体具有潜在的毒性，对生物体以及生态环境存在潜在危害。

陈丹、姚冬生、谢春芳、刘大岭在《中国生物工程杂志》上公开了一种“四环素核酸适配体电化学生物传感器的研制”，其利用等温滴定量热法筛选到的四环素核酸适配体做识别分子制作生物传感器，用电化学方法研究了该生物传感器检测四环素的电化学行为。结果：等温滴定量热法筛选出一条对四环素有高亲和力的适配体，解离平衡常数Kd＝51.8μmol/L。差分脉冲伏安分析，在5.0～5.0×10³μg/L浓度范围内，峰电流值的变化ΔIp与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系，相关系数R²＝0.9876,检测限为1.0μg/L，反应时间为15min。该检测限明显低于目前国家限定的四环素残留量(6.0×10²μg/L)，也低于目前其他报道的四环素适配体传感器的检测限。但该技术采用的普通固体电极，每次使用前均需要打磨、活化、清洗等前处理步骤，费时费力，且预处理后电极的均一性难以保证。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器，该生物传感器的丝网印刷电极的工作电极上依次修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层。

本发明涉及上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯超声分散在海藻酸钠水溶液中，得到均一的四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物；

所述的四氧化三铁/还原氧化石墨烯，即具有空心半球结构的四氧化三铁纳米颗粒均匀生长在还原氧化石墨烯片表面形成的一种纳米复合物，具体通过以下方式得到：

1.1)将氧化石墨烯、表面活性剂P123和/或F127，超声分散到溶剂中；

1.2)将可溶性铁盐和可溶性有机盐加入到上述溶液中，充分搅拌均匀后得到；

所述的溶剂为乙二醇、乙醇和水中的至少一种；

所述的可溶性铁盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或几种混合。

所述的可溶性有机盐为乙酸钠和/或乙酸钾。

2)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物修饰到丝网印刷电极的工作电极表面，室温下干燥成膜；

所述丝网印刷电极的工作电极的材质为碳；

3)将四环素核酸适配体涂布在修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物的工作电极表面，室温下干燥成膜后清洗即得。

所述的四环素核酸适配体，即76‐mer的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，具体为：