[发明专利]一种CHO细胞分泌能力评价系统

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体公开一种能够评估对CHO细胞进行基因改造后是否能影响了CHO表达与分泌能力的一套系统。本发明的表达系统包括真核表达载体及CHO表达评价细胞株。所述真核表达载体和稳定细胞株包括piggy转座子调控单元、筛选基因表达单元和抗体‑LucGFP融合报道基因表达单元。该表达系统能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合和高效表达，同时该系统可用于评估任何外源DNA片段包括基因，RNA等对CHO细胞分泌功能的影响，在改造CHO细胞提高蛋白产量方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体及其应用领域，具体地说是一种能够评估外源DNA片段是否会对CHO细胞的分泌能力产生影响的表达载体及系统，涉及基因工程制药领域。

背景技术

CHO表达系统是目前蛋白或抗体药物最主要的表达系统之一，在生物制药中得到了广泛应用。除了具备其他哺乳动物细胞所具有的指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种蛋白翻译后加工，以及生产出最接近于天然活性的蛋白药物等优势外，与其他细胞相比，CHO细胞能够获得较高的产物产量以及抵抗相对强的代谢压力，此外，CHO细胞属成纤维细胞，为非分泌型细胞，很少分泌内源蛋白，有利于目标蛋白的分离纯化。然而，目前CHO细胞的蛋白表达水平仍然不能满足市场的需要，因此改进国内CHO工程细胞株，提高其表达分泌的水平，成为提高我国的蛋白药物生产水平关键的关键。

经过多年来CHO细胞株优化，特别是通过GS/MSX或者DHFR/Mix扩增筛选系统，增加外源基因的拷贝数，已经极大地提高了蛋白的表达量。有研究表明，蛋白表达的限速步骤主要在转录和转录后的过程。一些与蛋白分泌相关的内质网蛋白与高水平的蛋白的生产紧密相关。然而由于细胞内ER stress的存在，使得拷贝数提高到一定数量，细胞分泌水平达到一个极限，表达量不但无法再提高，反而会下降。此外，过多的拷贝数也将是细胞内DNA和RNA代谢的浪费和细胞负担。仅靠提高外源基因的拷贝数很难进一步提高蛋白的表达，需要从其他方面对CHO细胞株进行生理活动的改造。

蛋白质的表达和分泌，从基因的转录开始，到最后输送到细胞外，涉及到细胞体内生命活动的各个方面，包括基因转录的水平，RNA稳定性调控，蛋白质的翻译水平，蛋白质的稳定性调控，蛋白质的分流和转运即分泌途径的调控。其中蛋白质的分流和转运是分泌蛋白水平的限制管道。蛋白质合成好之后，如何进入内质网，如何通过转运泡转运到高尔基体，再从高尔基体形成分泌泡，分泌泡如何转运到细胞膜，然后与细胞膜融合，将蛋白质分泌出去。每一次的蛋白转运、膜与膜融合、生物膜回流的效率直接影响了分泌蛋白的量，其中哪里效率低下，蛋白将滞留在哪里。此外还涉及细胞整体生理状况，如细胞的分裂速度，细胞的凋亡，细胞的密度，细胞代谢活动的平衡和耐受，细胞的能量应用和流向。因此有必要对CHO这些细胞活动各层面进行全面的、系统的基因改造，才能有可能进一步提高CHO药物蛋白分泌表达水平。

目前检测细胞分泌出的蛋白含量多是通过western blot，程序复杂且费时费力。如何更直接快速的寻找影响CHO细胞蛋白分泌过程的基因，是加快CHO细胞改造的一个关键步骤。

发明内容

本发明公开了一种能够直接衡量外源DNA片段能否对CHO细胞的分泌能力产生影响的评价系统。本发明利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞，利用TALEN技术向基因组中定点插入重组片段。该评估系统以lucGFP为报道基因，能够通过检测luciferase在细胞培养上清中的含量评估外源蛋白对细胞分泌能力的增强或抑制作用。应用了谷氨酰胺合成酶筛选系统的优势，经过压力筛选后得到定点插入的稳定细胞株。该系统将piggy位点整合到细胞基因组中，可通过piggyBAC转座子直接将报道基因从基因组中去除。从而获得稳定插入外源DNA片段的重组CHO细胞。本发明所提供的真核表达载体能够与外源基因连接，构建成融合表达载体，可简单快速地评估外源蛋白对细胞分泌能力的影响，并获得遗传改造的重组CHO细胞株。