[发明专利]一种间歇浸没式蕨类植物绿色球状体的增殖快繁方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种适用于蕨类植物绿色球状体(Green Globular Body，GGB)的增殖和再生的方法。

背景技术

植物组织培养技术，具有繁殖数量多且快速、实验条件易控制、可连续生产、生产效率高等优点，广泛应用于作物育种及种质资源保存以及花卉、果树、蔬菜、林木及中草药的脱毒苗生产与快繁无性繁殖等方面，例如百合脱毒籽球的无性快速繁殖。

传统的固体或半固体组织培养方式需要耗费大量的琼脂，并且在灌装及清洗时需处理大量容器，故耗费大量劳动力，导致生产成本居高不下。

目前国内外设计发明了一些植物组织间歇浸没式培养装置，其优势：一方面间歇式浸没培养方式使气体交换充分，氧气供应充足，降低了普通液体培养易产生畸形苗与玻璃化苗的机率，从而提高了培养质量与繁殖效率，另外，间歇式浸没培养方式利用自动化调控元件，辅助组织培养过程，减少了劳动密度，降低培养成本。但是，这类装置通常设备庞大，不易拆卸或移动，且控制元件复杂，维护成本较高，而且它们也不易于简便的无菌人工接种操作以及高效的装置整体清洗以及灭菌处理。

目前国内仅有对肾蕨、巢蕨、鹿角蕨等少数几种蕨类进行GGB培养的报道，所使用培养方法均为固体培养，尚无间歇浸没式培养GGB的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种间歇浸没式蕨类植物绿色球状体的增殖快繁方法。

本发明提供一种间歇浸没式蕨类植物绿色球状体的增殖快繁方法，其包括如下步骤：

1)将外植体进行无菌培养，诱导获得蕨类植物绿色球状体

2)将步骤1)获得的绿色球状体置于连通器式间歇式植物组织培养装置内进行间歇浸没式培养；

所述的连通器式间歇式植物组织培养装置包括培养容器装置、载物构件和运输配件，所述的培养容器装置包括容器主体以及通过螺纹啮合的密封盖体；所述容器密封盖体顶部设有气体交换的通孔；所述容器主体侧壁的一端其底部与顶部均各设一外伸开孔；所述载物构件包括载物筛盘以及固定框架，单个载物筛盘通过多个摞叠置于固定框架内，而固定框架再搁置于所述培养容器内；所述的运输配件包括硅胶软管、蠕动泵和储液容器，通过两条硅胶软管与所述的培养容器、蠕动泵、储液容器相连接。

其中，所述通孔的向下延伸管内装有杀菌纤维团和微孔滤膜，底部由不封口的螺纹塞固定。

其中，所述固定框架包括空心圆盘底座、垂直焊接于圆盘直径两边的固定杆和连接固定杆的提手；所述的空心圆盘底座包括空心圆环以及由空心圆环圆心辐射出三条两两角度为120度且与空心圆环相接的焊接杆，且焊接杆连接于空心圆环的位置再垂直向下延伸出支腿。

其中，两条硅胶软管使所述的容器主体与储液容器相连接，其中，第一条硅胶软管一端与容器主体底部外伸开孔相连，另一端与储液容器下部开口相连；第二条硅胶软管一端与容器主体顶部外伸开孔相连，另一端与储液容器上部开口相连；所述第一条硅胶软管嵌入蠕动泵。

其中，所述储液容器还设置有液体培养基注入口。所述的主入口还设置有密封盖。

其中，所述培养容器装置整体为透明可高压灭菌PC材质。

其中，所述连通器式间歇式植物组织培养装置使用前，整体或各个部件经高温高压灭菌，将蕨类植物的无菌GGB平铺于灭菌后的载物筛盘上，每个载物筛盘放置100-150个GGB，将多个装有GGB的载物筛盘摞叠并置于固定框架内，再将其放入培养容器内，使用盖体密封。

在本发明一个实施方案中，设置间歇式培养的程序，分别设为早上9－10点，下午15-17点和晚上21－22点各1个小时，蠕动泵会在设定时间内将储液袋内的培养基推入与排出培养容器主体。

其中，每培养5-10天，更新储液溶液内的液体培养基。

在本发明一个实施方案中，所述的液体培养基为可将蕨类植物GGB进行增殖的液体培养基。本领域技术人员可根据所培养的蕨类植物的种类，选择适合适合该物种的增殖液体培养基。

本发明优点：培养空间利用率高且利于培养气体成分交换，从而提高培养物质量与繁殖系数，适宜大规模生产；培养装置及配件，易于整体消毒灭菌，培养过程全封闭，污染机率小；结构简单紧凑，耗能低，节约了培养空间，降低了组培成本。蕨类植物的GGB为分化能力非常强的胚性组织，任意方向均有增殖和分化能力，于液体培养基中间歇浸没培养更有利于其各个表面的对培养基中营养成分的快速吸收，因此该方法能大大提高GGB的培养效率。