[发明专利]一种可利用蓝白筛选检测KRAS热点突变的引物对

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及分子生物学和临床检验医学领域，涉及基因工程和医学诊断。

背景技术

KRAS基因突变在肿瘤中发生频率较高，不但与多种肿瘤的发生发展相关，还与肿瘤的治疗选择密切相关。目前对KRAS基因突变的常用方法，包括直接测序分析，位点特异性引物扩增，PCR产物熔点曲线分析等。这些技术各有优缺点，目前对肿瘤早期筛查和治疗后效果监测领域，还需要研发没有假阳性而同时又具有高效率的新技术。

蓝白斑筛选(β-半乳糖苷酶系统)是分子生物学实验中较常用的筛选标记，具有高效和简单的优势，主要用于基础研究，包括提高克隆效率。近年来，蓝白斑筛选用于体细胞突变的体外基础研究，后者如big-blue小鼠和大鼠(ref)；以及用于人类遗传性突变的基因分析。但蓝白斑筛选技术用于人类KRAS基因突变，还是一种有待研发的新技术。

在离体研究中，此类载体携带lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端(α-肽)，并且处于诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解)诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15基因型(含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因)。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG的诱导下，质粒与宿主菌分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽(即α-互补)，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，菌落呈现蓝色。但当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，使其编码的α-肽失去活性，则重组子所在的细菌不能完成α互补，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重组菌形成白色菌落。因此，可以借助蓝白斑筛选出重组子。

在多种肿瘤相关突变中，如缺失突变，插入突变，和多种点突变，或者可以直接导致TAA,TAG,TGA等终止密码子的出现与丧失，或者通过人工移码技术获得野生基因与突变基因具有含或不含终止密码子的情形。这样，利用位于突变序列上下游的扩增引物对对其进行扩增，并将扩增片段插入原核表达载体，便可以得到蓝白颜色不同的菌落。本发明针对KRAS热点突变，获得了两条可检测基因突变的PCR引物对。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以在可能混合有野生与突变基因片段的生物标本中检测KRAS突变基因的引物对。

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种可利用蓝白筛选检测KRAS热点突变的引物对，其特征在于，上游引物a序列为TAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGT，SeqNo.2所示；下游引物d序列为:CGTCAGGATCCTTGGACCATATTCGTCCACA，如SeqNo.3所示。

本发明的两条引物的五末端分别带有用于亚克隆的限制性酶切位点HindIII位点和BamHI位点，还具有与KRAS基因热点突变位点侧翼序列完全互补的序列。本发明的引物针对野生序列的扩增产物在亚克隆后不产生终止密码子、针对热点突变的扩增产物在亚克隆后产生终止密码子。

本发明的引物对针对KRAS第12位的突变密码子tga，蓝白筛选检测中相应地产生的终止密码子为tga。

本发明的引物对针对KRAS第12位的突变密码子taa，蓝白筛选检测中相应地产生终止密码子为taa。

本发明的引物对针对KRAS第13位的突变密码子tga，蓝白筛选检测中相应地产生终止密码子为tga。

本发明提供了一种引物对用于检测KRAS基因的第12位密码子或第13密码子的突变，所述引物对a,d序列如SeqNo.2，SeqNo.3所示。

本发明还提供了一种检测试剂盒，其包含有如SeqNo.2，SeqNo.3所示的引物对a和d。

通过设计一对序列特异性引物，在KRAS基因热点突变的侧翼开始进行PCR扩增反应；将扩增反应亚克隆至具有蓝白筛选功能的原核载体，对待测标本中的野生序列片段与突变序列片段进行蓝白菌落斑筛选。本发明提供的引物对具有从数以百计和数以千计的野生基因片段中选择性对突变序列形成白色菌落的能力，蓝白斑筛选得到的白色菌落通过基因测序分析，一方面可以确定该待测标本中有无基因突变；另一方面，测序分析还能保证该引物对扩增得到的产物突变位点是十二位密码子还是十三位密码子。