[发明专利]一种对由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法。

背景技术

扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际市场上，对扁桃酸的需求约以年均10％左右的速度增长，尤其是(R)‐(‐)‐扁桃酸早已成为国内外急需的产品。

(R)‐(‐)‐扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由(R)‐(‐)‐扁桃酸拆分。

目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有：(1)物理化学法，其中包括不对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法。

申请号为201510334809.2的专利提出了一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法以取代传统的化学拆分法。该方法单批次反应(R)‐(‐)‐扁桃酸的累积浓度达到2.9M，ee值大于97％。为了使该方法生产出的(R)‐(‐)‐扁桃酸更容易达到产业化生产，有必要开发一种能够简便并且廉价地将(R)‐(‐)‐扁桃酸从终产物混合物中进行分离并纯化的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，该方法具有操作简便、分离效果好、成本低和周期短等优点。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤：

(1)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到反应液；

(2)、对步骤(1)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；

(3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，可以在20‐30℃的温度下收集析出的晶体并得到酸化液；

(4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理和结晶处理，收集析出的晶体；

(5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。

其中，步骤(1)所涉及的方法与申请号为201510334809.2的中国专利所用的方法相同。

在步骤(1)中，将扁桃腈以第一流加速度流加10‐12h，在剩余的反应时间内以第二流加速度进行流加，第一流加速度大于第二流加速度，优选为第一流加速度是第二流加速度的2倍。

在步骤(1)中，第一流加速度可以为10‐40gL^‐1h^‐1，第二流加速度可以为5‐20gL^‐1h^‐1；优选地，第一流加速度可以为15‐35gL^‐1h^‐1，第二流加速度可以为7.5‐17.5gL^‐1h^‐1；更优选地，第一流加速度可以为20‐30gL^‐1h^‐1，第二流加速度可以为10‐15gL^‐1h^‐1；最优选地，第一流加速度为24gL^‐1h^‐1，第二流加速度为12gL^‐1h^‐1。

在步骤(1)中，pH可以为7‐8.5，还可以优选为7.9‐8.1；温度可以为25‐37℃，还可以优选为30℃。

在步骤(1)中，转化液的制备方法包括如下步骤：

a、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养并诱导表达，离心以得到静息细胞；

b、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。