[发明专利]一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及外源基因导入微生物的方法，尤其涉及一种将构建的含有外源基因的质粒导入乳酸乳球菌的高效超声波转化方法。

(二)背景技术

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是乳品工业发酵的重要菌种，也是腌制蔬菜、肉制品的常用菌种，在食品加工中有着重要的作用。乳酸乳球菌由于具有生长迅速、易于操作、安全性高等诸多优点，使其在基因工程疫苗领域成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗传递抗原的最佳选择。人们利用DNA重组技术，使其携带外源基因并表达外源基因产物，从而发挥更大应用价值。然而，作为革兰氏阳性细菌，乳酸乳球菌细胞壁含有丰富的肽聚糖，细胞壁较厚，机械强度大，利用传统的化学转化法很难将外源基因导入，故目前广泛采用的是电转化法。

传统基因转化方法有化学促进法，载体介导法和机械法等，这些方法尽管得到广泛应用，也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的过程繁冗，有的成本昂贵，特别是一些细胞只对某一个或某几个方法敏感。而物理方法是基于细胞膜的破坏来提高通透性，不依赖于细胞型，因此更具有广泛应用价值。超声波是一种传统的细胞破壁技术，被认为是一种潜在的转化方法。超声波作用细胞可以引起细胞发生多种变化，细胞变化范围可以是：无明显变化、细胞通透性增加和细胞全溶解。同是物理方法，超声波技术和电穿孔技术相比也有较直接优势，电穿孔不仅要求有较低的离子介质和较高的电压，并且接合要求有直接细胞-细胞接触。而超声波没有任何离子介质和电压要求，使得他更有优势。因此，超声波作为一种机械方法应用更加广泛，且不依赖于细胞型。从理论上讲可以在细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞间转化，目前在哺乳动物和植物中应用较多，而在微生物上鲜见报道，建立较系统的转化方法，将有很广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明提供一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，该方法新颖、转化条件温和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活力低，易死亡等问题。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液是由乳酸乳球菌感受态细胞与冰水预冷的溶液Ⅰ重悬而成；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水。

进一步，所述转化反应在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下反应10～30min。

进一步，所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因，核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

进一步，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)NZ3900，购自NTCC典型培养物保藏中心，保藏编号NZ3900。

进一步，所述携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液体积比为1:40-55，所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1×10⁷～1×10⁸个细胞/ml。