[发明专利]一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，具体涉及靶向多肽(TK肽)修饰的PPV衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒所构成的主动靶向纳米递药系统及其制备方法，该主动靶向纳米递药系统包载小分子抗肿瘤药物后，可用于靶向治疗结肠癌。本发明属于多肽、生物技术和药剂学领域。

背景技术

中国肿瘤生物治疗协会2013肿瘤发展报告统计数据表明，恶性肿瘤占所有死亡人数的20％左右；每年肿瘤疾病的发病率和死亡率都在急剧增加着，《2012中国肿瘤登记年报》发布的最新统计数据表明，中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，恶性肿瘤已经成为危害人类生命和健康的头号杀手。结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在男性和女性恶性肿瘤中分别居第三位和第二位，2008年新发癌症患者超过120万，有60.87万癌症患者死于结直肠癌。在我国，结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康。因此，如何有效治疗结直肠癌已成为全球健康领域亟待解决的难题。相关研究表明，靶向性给药可以增强药物在靶部位的活性并减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数，给药系统是靶向治疗的关键。近年来本领域的研究重点之一是寻找与可特异性与肿瘤细胞或肿瘤新生血管结合的物质，以及将药物递送到肿瘤的新型递药系统。

病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，因为VLPs不含有病毒核酸物质，不能自主复制，因此也不具有感染性。猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是细小病毒科细小病毒属成员，PPV基因组编码两条结构多肽VP1和VP2，三条非结构多肽NS1、NS2和NS3。VP2分子质量为64ku，约占病毒衣壳蛋白总量的80％，在一定的环境下，VP2能自组装成VLPs，其形态与PPV相似。病毒样颗粒虽然是安全、有效的纳米载体，但是VLPs选择性相对较差，缺乏对肿瘤细胞的特异性。因此，通过靶向分子介导VLPs对肿瘤细胞的选择性，是一种有效的主动靶向方式。目前尚无靶向分子修饰的PPV-VLPs的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有抗癌化学药物的毒性及非特异性问题，提供一种新型的主动靶向纳米递药系统。

为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：

一种基于PPV病毒样颗粒的纳米递药系统，其特征在于，是由纳米载体材料和药物组成，所述的纳米载体材料为TK肽修饰的PPV病毒样颗粒，采用昆虫杆状病毒表达系统制备得到；所述的药物为小分子抗肿瘤药物；所述药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体材料内。

在本发明中，优选的，所述的TK肽为靶向多肽，其氨基酸序列为：TWYKIAFQRNRK；所述的PPV病毒样颗粒为PPV的衣壳蛋白VP2形成的病毒样颗粒；TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比为1:1～20:1。

在本发明中通过控制Δvp2基因中TK肽的基因与VP2基因的拷贝数来调节TK肽与PPV病毒样颗粒的摩尔比。

在本发明中，优选的，所述的TK肽修饰的PPV病毒样颗粒通过以下方法制备得到：将TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到Δvp2基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHA中，所得的重组杆状病毒转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，使其表达Δvp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。

在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

(1)以提取的PPVDNA为模板，利用扩增引物通过PCR扩增获得VP2基因，将VP2基因插入pMD18-T载体中，得到重组载体pMD18-T-vp2；

(2)以重组载体pMD18-T-vp2为模板，应用SOE-PCR扩增获得Δvp2基因，将Δvp2基因插入杆状病毒转移载体pFastBacHA中，得到pFD-Δvp2供体质粒；

(3)将pFD-Δvp2供体质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，与Bacmid进行重组，得到重组杆粒Bacmid-Δvp2；

(4)将重组杆粒Bacmid-Δvp2转染Sf9细胞，待细胞病变达到70％以上收集上清培养液，即第一代重组杆状病毒，连续传代后，以第三代重组杆状病毒作为种毒；

(5)将得到的第三代重组杆状病毒接种Sf9细胞，使其表达Δvp2蛋白并组装成TK肽修饰的PPV病毒样颗粒。