[发明专利]利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗条纹花叶病甘蔗的方法

说明书

本发明涉及一种利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗条纹花叶病毒转基因甘蔗的方法，包括SceIF4E1基因的克隆、RNAi干扰载体构建、遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定。以SceIF4E1作为RNAi干扰靶序列，经遗传转化后获得的转基因植株，产生了对甘蔗条纹花叶病毒不同株系的广谱抗性，具有抗病性好、抗性持久且生物安全性高的特点，使转基因甘蔗的培育摆脱了对抗源基因的依赖，并且可以有效缩短甘蔗抗花叶病育种周期。采用本发明的方法培育抗花叶病转基因甘蔗，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。

技术领域

本发明涉及一种培育甘蔗(Saccharum sp.hybrid)抗病品种的方法，具体涉及一种利用RNAi沉默SceIF4E1基因培育抗甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaicvirus,SCSMV)的甘蔗品种的方法，即利用RNAi技术干扰甘蔗中真核翻译起始因子基因SceIF4E1培育抗SCSMV转基因甘蔗的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗(Saccharum sp.hybrid)是我国乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物，甘蔗糖占我国食糖总量的92％，占世界食糖总量的74％，甘蔗乙醇占世界生物质燃料乙醇的60％。甘蔗花叶病是严重危害甘蔗生产的病毒性病害之一，在我国广西、云南、广东、海南等地蔗区普遍发生(李文凤等,2007；许东林等,2008)。甘蔗感染花叶病后，叶片出现黄绿相间、大小不一的条纹，种苗萌芽率下降，分蘖减少，植株矮小，生长缓慢，品质变劣，蔗糖结晶率下降(Joyce et al.,1998；Wu et al.,2012；Li et al.,2013)。甘蔗花叶病的病原主要有3种，即SCSMV，甘蔗花叶病毒(Sugarcane Mosaic Virus,SCMV)和高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)，均属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)(李文凤等,2007；许东林等,2008；Xu et al.,2008；熊果如等,2011)。SCMV和SrMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。SCSMV于1978年在美国首次发现并报道，1998年确定其属于Potyviridae，2012年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)将其立为该科新属，即禾病毒属(Poacevirus)(http://www.ictvonline.org)。SCSMV主要分布在中国、孟加拉、印度、日本、印度尼西亚、巴基斯坦等地，在中国甘蔗主产区广西、云南呈现爆发式流行，在广东、浙江和福建等地普遍发生并广泛传播(Li et al.,2011)，田间发病率达到50％时，产量损失高达20％(Putra et al.,2013)。

SCSMV为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，长度约为10Kb，编码一个大的多聚蛋白(ployprotein)，经酶解后形成10个成熟蛋白，从N端到C端依次为：第一蛋白(P1)、辅助成分-蛋白酶(helper component proteinase,HC-Pro)、第三蛋白(P3)、第一个6K蛋白(6K1)、柱状内含体蛋白(cylindrical inclusion protein,CI)、第二个6K蛋白(6K2)、病毒基因组末端结合蛋白(Viral Protein Genome-linked,VPg)、核内含体a蛋白(Nuclear Inclusiona protein,NIa)、核内含体b蛋白(Nuclear Inclusion b protein,NIb)和外壳蛋白(CoatProtein,CP)(Riechmann et al.,1992；Urcuqui-Inchima et al.,2001)。另外，在P3基因内部，在G₂A₇保守结构域发生移码，编码一个新的蛋白，为P3NPIPO(Chung et al.,2008；Weiet al.,2010；Vijayapalani et al.,2012)。