[发明专利]一种大豆遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆遗传转化方法。

背景技术

大豆(GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育的重要手段。

大豆目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。根癌农杆菌转化体系周期长(通常是用发芽5天的种子制备外植体)、转化效率低，制约着大豆分子育种的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆遗传转化方法。

本发明提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。

所述制备大豆外植体的方法可为：取种子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤5-7次(具体可为6次)。

所述发芽1d的大豆种子的制备方法可为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养基上，培养1天。所述培养的条件可为：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述灭菌具体可为氯气灭菌。所述氯气灭菌的方法具体可为：将大豆种子平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中，在干燥器中放入一个100ml容量的烧杯(向烧杯中先倒入80ml浓度为12M的次氯酸钠水溶液，再缓慢加入4ml浓盐酸)，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置12-16小时(具体可为14小时)。所述发芽培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、30g蔗糖、1mlB5有机和7.5g琼脂溶于1L水。

所述大豆具体可为大豆品种Jack。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体在大豆遗传转化中的应用。

本发明还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化。

所述“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”的方法如下：

(1)将“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”置于侵染菌液中，室温浸泡2小时；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；

(2)完成步骤(1)后，取外植体，采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上培养5天；

(3)完成步骤(2)后，取外植体，在恢复培养基上培养7天；

(4)完成步骤(3)后，取外植体在筛选培养基上培养21天；

(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；

(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部，然后在生根培养基上培养至生根。

所述步骤(2)具体为：完成步骤(1)后，取外植体，将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天。

所述步骤(6)具体为：完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部1min，然后在生根培养基上培养至生根。

所述步骤(2)中，所述培养的条件可为：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(3)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(4)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(5)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(6)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。