[发明专利]诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法

说明书

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC‑MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。并且，该培养液中不含有异源血清，降低了风险。而本发明提供的方法将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，能够显著提高分化百分率且所需培养周期较短。采用的脐带间充质干细胞来自脐带和胎盘，来源广泛，不受伦理和法理限制。

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法。

背景技术

角膜上皮细胞层位于角膜外表面，由4～5层非角化鳞状上皮细胞组成，在维持眼表稳态以及角膜透明度中发挥重要作用。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源，多种致病因素如眼外伤、手术创伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失，从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜修复的上皮细胞这一难题亟待解决。

临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。角膜缘干细胞同其它干细胞一样具有分化程度低、细胞周期长、高度增殖潜能、自我更新能力和应激增殖等特征，并且研究发现体外培养的角膜缘干细胞可能会失去部分抗原性，有利于临床移植。也有研究表明，通过建立角膜上皮细胞系(cornealepithelial cell line)能够长期稳定地为不同研究目的提供所需的细胞，如上皮的增殖、分化、眼科用药的测试、角膜疾病新的治疗方法的开发等等。

但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且，脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。

因此，建立体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的有效方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法，本发明提供的诱导培养基能够和诱导方法能够成功将hUC-MSCs诱导分化为角膜上皮细胞，诱导分化率可达26％。

本发明提供的诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基，包括基础培养液、表皮生长因子和胰岛素。

表皮生长因子(EGF)能够促进表皮细胞的分裂，胰岛素能够促进细胞对葡萄糖、氨基酸的代谢，提高细胞的生长状态。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。实验表明，添加表皮生长因子和胰岛素的实验组hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化率可达26％，而不添加表皮生长因子或胰岛素的对照组分化率仅为5.47％。说明通过添加EGF和胰岛素能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

在一些实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000～3:2000。

在其中一个实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。

在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL～25μg/mL；胰岛素的含量为5ng/mL～25μg/mL。