[发明专利]超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法

说明书

技术领域

本发明涉及维生素D检测的技术领域，特别涉及一种超高效液相色谱串联质谱检 测血清25羟基维生素D的方法。

背景技术

维生素D为脂溶性非必需维生素，是固醇类衍生物，25羟基维生素D是维生素D在肝 微粒体25羟化酶的作用下转化形成，由于其与维生素D的其他代谢产物相比，在血液中的浓 度高且循环周期长，而成为维生素D体内浓度的良好指示剂，是人体维生素D营养状况的评 价指标。

维生素D家族成员中最重要的是维生素D₂和维生素D₃。维生素D₂多含于植物性食物 中，它是植物的麦角固醇经阳光照射而合成。维生素D₃占人体总量90％-95％，主要是由皮 肤内的7-脱氢胆固醇在特定波长的紫外线照射作用下合成，也可通过食物摄取获得。维生 素D具有调节人体血清钙磷代谢，维持骨骼和肌肉的正常生理作用。随着对于维生素D的深 入研究发现，人群中维生素D缺乏普遍存在，且维生素D缺乏与各类疾病的发生和发展密切 相关，比如肥胖、高血压、糖尿病、心梗等心血管疾病和代谢综合征疾病。因此维生素D缺乏 与各类疾病的相互关系引起国内外研究机构的广泛关注。

传统的25羟基维生素D检测方法有放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光法、电 化学发光法和高效液相色谱法等。但主要存在如下问题：第一，由于25羟基维生素D在人体 内主要与血清结合蛋白结合，人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的 基质干扰。而传统的放射免疫法和发光法，不能有效去除基质干扰；第二，现有检测技术前 处理过程复杂、方法特异性差；第三，免疫法有时存在交叉反应，出现假阳性结果，同时发光 法存在发光效率低等问题。因此免疫法和发光法不能同时准确定量25羟基维生素D₂和25羟 基维生素D₃的含量，无法给出准确的25羟基维生素D的总含量；第四，上述传统方法整个检 测过程时间长、通量低。

因此，需要分析领域技术人员迫切解决的一个问题就是：如何提供一种适合用于 人体血清的25羟基维生素D的检测方法。相比传统免疫法和液相色谱法，液相色谱串联质谱 法(LC-MS/MS)能够解决上述问题，目前国际普遍认为LC-MS/MS是检测血清中25羟基维生素 D的“金标准”。然而该“金标准”处理过程复杂，灵敏度和精密度有待进一步提高。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的不足，提供一种适用于人体血清的25羟基维生素D的 检测方法，能够有效去除基质干扰，快速检测。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法包括如下步骤：

(1)向血清样品中加入体积为血清样品体积1/15至2/15的25羟基维生素D的内标 物，加入硫酸锌溶液和甲醇溶液进行蛋白质沉淀；充分混匀后加入正己烷溶剂萃取；再充分 混匀后离心，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮气吹干沉淀，再加入复溶液，得到待测 样品；所述25羟基维生素D内标物包含⁶d-25羟基维生素D₂和/或⁶d-25羟基维生素D₃；所述复 溶液为甲醇和水按7:(2—4)，优选7:3的体积比混合的混合液；

其中，所述血清样品、硫酸锌溶液、甲醇溶液、正己烷溶剂的体积比为1:(0.8— 1.2):(1.8—2.2):(4—6)，优选1:1:2:5；所述复溶液与血清样品的体积比为1:(1.8— 2.2)，优选1:2；

(2)对待测样品用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测。

优选地，步骤(2)所述质谱采用正离子模式，并采用多反应监测离子扫描MRM的扫 描方式；

所述正离子模式中，内标定量离子对包括⁶d-25羟基维生素D₂定量离子对和⁶d-25 羟基维生素D₃定量离子对；目标定量离子对包括25羟基维生素D₂定量离子对和25羟基维生 素D₃定量离子对；目标定性离子对包括25羟基维生素D₂定性离子对和25羟基维生素D₃定性 离子对；

内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为：