[发明专利]超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法

权利要求书

1.超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素D的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤：

(1)向血清样品中加入体积为血清样品体积1/15至2/15的25羟基维生素D的内标物，加 入硫酸锌溶液和甲醇溶液进行蛋白质沉淀；充分混匀后加入正己烷溶剂萃取；再充分混匀 后离心，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮气吹干沉淀，再加入复溶液，得到待测样品； 所述25羟基维生素D内标物包含⁶d-25羟基维生素D₂和/或⁶d-25羟基维生素D₃；所述复溶液 为甲醇和水按7：(2—4)的体积比混合的混合液；

其中，所述血清样品、硫酸锌溶液、甲醇溶液、正己烷溶剂的体积比为1:(0.8—1.2): (1.8—2.2):(4—6)；所述复溶液与血清样品的体积比为1:(1.8—2.2)；

(2)对待测样品用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述质谱采用正离子模式，并采用多 反应监测离子扫描MRM的扫描方式；

所述正离子模式中，内标定量离子对包括⁶d-25羟基维生素D₂定量离子对和/或⁶d-25羟 基维生素D₃定量离子对；目标定量离子对包括25羟基维生素D₂定量离子对和/或25羟基维生 素D₃定量离子对；目标定性离子对包括25羟基维生素D₂定性离子对和/或25羟基维生素D₃定 性离子对；

内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为：

⁶d-25羟基维生素D₂定量离子对的母离子的质荷比为419.3，对应的子离子的质荷比为 83.1；

⁶d-25羟基维生素D₃定量离子对的母离子的质荷比为407.3，对应的子离子的质荷比为 159.1；

目标定量离子和目标定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为：

25羟基维生素D₂的母离子的质荷比为413.35，对应的定量离子的质荷比为395.3，定性 离子的质荷比为83.1；

25羟基维生素D₃的母离子的质荷比为401.35，对应的定量离子的质荷比为383.3，定性 离子的质荷比为159.1；

所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件为：

色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18Column(2.1x50mm,1.7μm)；

色谱柱柱温：45℃；

进样量：20ul；

流速：0.4ml/min；

流动相：流动相A为含2mM乙酸铵和0.1％甲酸的水，流动相B为含2mM乙酸铵和0.1％甲 酸的甲醇；

⁶d-25羟基维生素D₃和25羟基维生素D₃的保留时间为3.09min，⁶d-25羟基维生素D₂和25 羟基维生素D₂的保留时间为3.16min；

(3)以25羟基维生素D₂和25羟基维生素D₃的保留时间为定性依据，判断25羟基维生素D₂和25羟基维生素D₃的存在；

依据25羟基维生素D₂和25羟基维生素D₃与对应内标物在内标标准曲线上的峰面积比 值，计算血清样品中的25羟基维生素D₂和25羟基维生素D₃的含量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应监测离子扫描MRM的锥孔电压、驻留 时间、碰撞能量条件如下：

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4.根据权利要求2所述的方法，所述梯度洗脱的条件如下：

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