[发明专利]一种基于G-四聚体的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及金属离子检测领域，特别是指一种基于G-四聚体的检测方法。

背景技术

核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。G-四聚体是一段非常巧妙的、多功能的富G核酸序列，因其具有的适体特性及过氧化物酶活性能够使信号底物产生颜色、荧光等多种信号而被广泛用作核酸检测技术的信号报告分子。本发明中使用的核酸适配体有两段核酸组成：1、probe1；2、G-四聚体probe2，probe2能够与检测的物质形成G-四聚体，不能与probe3结合，T线不出线；当不存在检测物质的时候，核酸适配体就能够与probe3结合和probe4同时结合，T线呈现出红色。游离的NMM自身的荧光强度很弱，易于与G4链体结合后，荧光很强，荧光激发波长为399nm，最强发射峰波长在610nm左右，本发明利用NMM与G4聚体结合可稳定G4聚体的结构的特点。

铅及其化合物对人，特别是儿童的危害极大，其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤。铅广泛的存在于汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆、劣质儿童玩具、铅酸蓄电池、工业电镀、冶炼产生的废水、食品中的爆米花、皮蛋、锡箔纸包装的食物等中，这些铅最终富积在水中并无法降解，从而被人体吸收。目前，环境水中痕量铅的检测方法有分光光度法、电感耦合等离子-原子发射光谱法和电化学法等。这些方法需要分离富集，操作繁琐费时或需配置大型仪器，不利于现场检测，因此，需要开发中一种简便的检测方法。

发明内容

本发明提出一种基于G-四聚体的检测方法，在进行铅离子的检测中，具有操作简便，易于观察，检测时间段，灵敏度高等的特点。

本发明的技术方案是这样实现的：一种基于G-四聚体的检测方法，利用G-四聚体进行铅离子的胶体金检测。

进一步，所述基于G-四聚体的检测方法包括以下步骤：制备反应液、制备胶体金、制备胶体金-核酸偶联物和检测。

进一步，制备反应液步骤包括：分别配置不同浓度的多种铅离子溶液，作为标准品溶液以绘制标准曲线；配置G-DNA并分别与等体积的样品溶液及标准品溶液混合，使其充分相互作用。

进一步，制备胶体金步骤包括：在圆底烧瓶中加入100ml0.01％的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾，并向上述溶液中加入4ml1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到胶体金溶液，胶体金溶液4℃避光保存。

进一步，制备胶体金颗粒-核酸偶联物步骤包括：

(1)取10倍浓缩的金纳米颗粒900μL，加入100μL超纯水溶解的巯基修饰的DNA(DNAprobe4)，充分混匀；

(2)4℃反应24小时，已充分反应为准；

(3)选用10％的BSA进行封闭，逐滴加入10％的BSA约100μL，加边震荡，使BSA的终浓度为1％，充分混匀；

(4)4℃封闭3-5小时，优选为4小时，以封闭充分为准；

(5)加入1.5M的NaCl溶液和1％的SDS溶液，缓慢滴加，边加边震荡，使NaCl的终浓度为150mmol/L，SDS的终浓度为0.01％，充分混匀；

(6)4℃老化24小时，以老化充分为准；

(7)4℃离心，优选参数为12,000rpm，20分钟，弃上清，沉淀用金重悬液(含20mmol/LNa₃PO₄、3％BSA、0.25％Tween-20和10％的蔗糖，pH为7.5)重悬，重复离心2-3次，弃上清，留沉淀；

(8)用1mL金重悬液重悬核酸-金标记物沉淀，4℃保存备用；

进一步，检测步骤：将上述反应液加入2微升AuNP-核酸偶联物，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min。

本发明基于铅离子与核酸适配体反应形成G-四聚体的原理，设计的这种检测方法操作简便，检测结果使用肉眼就能观察到，因此被可广泛地应用于基层实验室中。

与现有技术相比，上述技术方案的优点在于，其优点在于该检测方法操作简单，特异性好，不受反应体系中其它离子比如K+的影响；对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测；灵敏度高，对铅离子的检测限为20nM，达到FDA规定的饮用水中铅离子的最低检测限(72nM)；实验结果用肉眼就能观察到，定量检测不需要使用复杂的仪器，使用普通的读卡仪就能读数。

附图说明