[发明专利]金黄地鼠肾原代细胞培养液

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种金黄地鼠肾原代细胞培养液。

背景技术

原代细胞是指从生物体（通常指人体器官或组织以及小鼠、大鼠、兔子、狗和家禽等动物器官和组织）取出后立即培养的细胞，也有人将培养的第一代与传五代以内的细胞统称为原代细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，还可以应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等，在生物医药领域有着不可替代的作用，市场前景非常广阔。

原代细胞培养是指将从动物机体内取出的器官或组织经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理后分散成单细胞，再置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

细胞培养基是人工模拟细胞在生物体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液和培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当为粉剂时，倾向性的称为培养基，将粉剂配制成液体后，多称为培养液，培养液中常常补加血清、抗生素等成分。

天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。虽营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。

无血清细胞培养基是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成不含有任何动物组分。由于技术原因，目前仍无法完全模拟天然血清的营养成分。当前市售的无血清培养基多针对传代细胞设计，如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基和NS0细胞无血清培养基等。

合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。合成细胞培养基是目前生物行业内使用最广泛的培养基。自1950年199细胞培养基问世以来，合成细胞培养基发展至今已有几十种。由于细胞种类和培养条件不同，合成的细胞培养基成分也不同，在动物细胞培养中最常用的基础细胞培养基就有6~7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、PRMI1640、199等，其培养效果也各有优劣。

由于天然培养基的确切成分无法完全解析，导致重复性差，批间差异大，产品质量不稳定。目前市场上用于细胞培养的主要为各种合成培养基，即通过人为地加入一些营养物质（有机的和无机的）、维生素、盐、O₂和CO₂气体、血清蛋白、碳水化合物、辅因子等制备的合成培养基。

不同的人工培养基被分别设计用于不同的用途，按照细胞特性主要分为基础全系培养基、适用于传代细胞的培养基和适用于原代细胞的培养基。

虽然原代细胞的用途很多，但原代细胞的培养条件却最为苛刻。如狂犬疫苗生产中所用的金黄地鼠肾原代细胞培养时，使用现有的培养基经常出现细胞贴壁时间长、生长速率慢，形态差，活性降低，易老化，缓冲系统不稳定引起的pH值变化大等现象；特别是当原代细胞做传代培养时，细胞活性和增殖能力逐代降低，导致培养失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能更好的促进原代细胞生长，尤其是满足当前疫苗生产中大规模原代细胞培养的金黄地鼠肾原代细胞培养液。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的金黄地鼠肾原代细胞培养液，所述培养液的组分包括Hanks’平衡盐溶液、水解乳蛋白、L-谷氨酰胺、L-盐酸半胱氨酸、新生牛血清、硫酸庆大霉素/卡那霉素；其配制过程如下：

第一步，配制Hanks’平衡盐溶液

取Hanks’平衡盐，加注射用水，充分溶解后得到Hanks’平衡盐溶液备用；

第二步，配制营养液

按比例称量水解乳蛋白90份，L-谷氨酰胺4份，L-盐酸半胱氨酸1.9份，用注射用水将其充分溶解后得到营养液备用；

第三步，配制培养液

将第一步配制的Hanks’平衡盐溶液和第二步配制的营养液按比例分别在无菌状态下过滤到配液罐中，然后将新生牛血清75~120份和硫酸庆大霉素溶液/卡那霉素溶液6份分别过滤至配液罐中，添加注射用水定容，搅拌均匀后即可得到金黄地鼠肾原代细胞培养液。

所用注射用水的温度为31~37℃。

所述第一步中配制的Hanks’平衡盐溶液为5~20倍浓缩液，最好为10倍浓缩液；所述第二步中配制的营养液为5~15倍浓缩液，最好为10倍浓缩液。

第三步中的新生牛血清的浓度为7.5-12%，其最佳浓度为8.5%。