[发明专利]一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法

说明书

本发明公开了一种逆转录病毒基因转移联合双重组酶介导的盒式交换（Dual‑RMCE）技术介导的T细胞受体（TCR）基因置换系统及其方法，包括含有置换组件Loxp‑EGFP‑FRT逆转录病毒整合载体pMP71‑LGFPF和含有TCR目标基因的置换载体pDRAV‑3‑LTCRF。该系统能够在基因组单一位点中快速进行TCR基因置换，利用体内外细胞分化技术产生大量的肿瘤抗原特异性T细胞，从而表达某一肿瘤抗原特异性的TCR分子。该技术克服了传统TCR基因治疗的问题：逆转录病毒随机整合带来的副作用和外源性与内源性TCR组合形成的自身反应性TCR，将为临床抗肿瘤T细胞免疫治疗提供一个安全可靠的新技术。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过增强抗肿瘤免疫力来治疗恶性肿瘤的，近年来的临床试验取得了令人瞩目的成果。其中，用针对特异性靶标的T细胞受体(TCR)开展的抗肿瘤T细胞免疫治疗获得了长足进展，已开始进入临床试验，获得了客观疗效。早期T细胞治疗的临床试验，多采用抗肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)的方式，结果显示只在一些肿瘤如黑色素瘤里存在比较多量的TIL，在体外扩增回输到患者体内有明显的肿瘤消除作用。由于免疫耐受和肿瘤微环境抑制作用，在多数肿瘤组织中TIL的数量是有限的，而且多数是耗竭的T细胞(exhausted T cell)。

能引起抗肿瘤T细胞反应的抗原种类包括：(1)机体外源性抗原或体细胞基因突变产生的新抗原；(2)没有基因突变免疫耐受不完全的自身抗原，在肿瘤细胞异常表达。T细胞在胸腺发育成熟的过程中，会对间质细胞表达和呈递的自身抗原不产生免疫应答，这种机制称为中央耐受。在中央耐受机制的作用下，T细胞经历阴性筛选，即一些对自身抗原有高亲和力的T细胞克隆被清除，产生的正常T细胞库不会对自身组织产生免疫反应。而多数肿瘤相关抗原(TAA)本身就是未发生基因突变的在肿瘤细胞异常表达的自身抗原，由于免疫耐受机理，所以T细胞对这些TAA不能够发生有效的免疫反应。

为了克服免疫耐受，并得到高亲和力的抗肿瘤TCR基因，李亮平等在德国分子医学中心(Max Delbrueck Center for Molecular Medicine，MDC)，构建了人TCR-HLA人源化小鼠(ABabDII)，利用该小鼠模型分离到了一系列高亲和力肿瘤抗原特异性的TCR基因。这些TCR基因可以用于抗肿瘤T细胞免疫治疗：通过TCR基因转移的方法改造原代T细胞，将普通的淋巴细胞转变为特异识别肿瘤抗原的T淋巴细胞，然后在体外大量扩增回输至病人体内，用于临床治疗。基因工程化的T细胞免疫治疗最大的好处在于，可以修饰和增强T淋巴细胞的功能短期内产生打量抗肿瘤T细胞，以达到治疗目的。用肿瘤抗原特异性TCR基因修饰的T细胞，不但在转移性恶性黑色瘤病人身上取得良好的效果，而且在滑膜肉瘤，B-细胞淋巴瘤(B-CLL)，肾癌和结直肠癌等的过继免疫治疗也获得肿瘤消退。

TCR基因治疗存在着一些问题：目前抗肿瘤TCR基因通常用逆转录病毒载体转导至T细胞，由于病毒转导是多拷贝且随机整合的过程，有可能会灭活抑癌基因、活化原癌基因而诱发白血病，同时转导进去的TCR链可能会与内源性的TCR链随机组合可能形成自身反应性的TCR分子，从而诱发自身免疫性疾病，如：移植物抗宿主疾病(GVHD)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种Dual-RMCE介导的单拷贝TCR基因置换系统，避免逆转录病毒基因随机插入带来副作用，同时结合胚胎干细胞(ES)或诱导多潜能干细胞(iPS)体内外分化技术，获得肿瘤抗原特异性的T细胞。

本发明的第二个目的是提供利用上述系统进行TCR基因置换的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：