[发明专利]一种测定非同源末端连接修复活性的方法

说明书

本发明公开了一种测定非同源末端连接修复活性的方法，该方法采用基因定点突变技术来对HPRT基因进行突变，之后需要质粒转染、药物处理、6‑TG处理步骤，最后通过简单的细胞活力检测来观察NHEJ修复的活性，这种方法可以通过检测细胞活力来观察细胞NHEJ修复的活性水平，可用于筛选不同药物、不同基因对NHEJ修复的作用，测定不同细胞系对NHEJ活性抑制药物和基因的反应，从而可以发现具有化疗和放疗增敏效果的药物和基因。

技术领域

本发明涉及一种测定非同源末端连接修复活性的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)是一种细胞修复DNA双链断裂的通路，该修复过程不需要模版染色体的参与，能够直接重新连接两个断裂的DNA末端。然而与另外一种同源重组(Homologous recombination,HR)修复不同，NHEJ修复往往伴随着核苷酸的插入或缺失，从而使基因发生突变，失去基因的功能。

DNA作为遗传信息的保存者，其完整性对细胞来说至关重要。多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内具有应对不同形式损伤的复杂的修复系统。其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为最严重最致命的损伤形式，如果没有被及时修复，将导致细胞死亡。在肿瘤的临床治疗中，放疗和多数化疗药物可以导致肿瘤细胞DNA双链断裂，肿瘤细胞主要通过NHEJ和HR修复来对断裂的DNA双链进行修复，其中NHEJ不存在细胞周期依赖性，是细胞中修复DNA双链断裂的主要方式，其活性在一定程度上决定了肿瘤细胞对电离辐射和化疗药物的敏感性，当肿瘤细胞中的NHEJ修复活性被抑制后，放疗和化疗的效果能得到明显的改善。

目前可以用来测定NHEJ活性的方法主要有DNA双链断裂特异性蛋白γH2AX和53BP1染色，DNA断裂片段的中性彗星电泳，以及采用比较复杂的分子生物学手段来研究NHEJ的活性，如在大范围核酸酶I-SceI基础上设计的针对NHEJ修复活性的报告质粒，转染细胞后筛选稳定表达细胞株，再引入I-SceI核酸酶进行DNA双链断裂的诱导，最后通过观察报告质粒的荧光表达来反应NHEJ修复的能力(Identification of NovelRadiosensitizers in a High-Throughput,Cell-Based Screen for DSB RepairInhibitors，Alexander G，《Molecular Cancer Therapeutics》第14卷，第326-342页，2015年2月)。但是上述这些方法比较复杂且步骤繁多，而且需要一些特异性的染色以及对特定细胞株的筛选。

基因组定点编辑技术目前发展迅速，现在主要有三种类型，锌指核酸内切酶(Zincfinger nucleases,ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，规律性重复短序列丛集及其系统(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/CRISPR associatedsystem,Cas9)，这些技术可以对基因组中特定的DNA位点进行切断，通过诱导NHEJ或HR修复来达到对基因定点编辑的目的，而且突变效率高、制作简单、成本较低。因此如何利用基因组定点编辑技术来简明的测定非同源末端连接修复活性成为当前亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种测定非同源末端连接修复活性的方法。