[发明专利]一种测定非同源末端连接修复活性的方法有效
| 申请号： | 201510478296.2 | 申请日： | 2015-08-07 |
| 公开（公告）号： | CN104962523B | 公开（公告）日： | 2018-05-25 |
| 发明（设计）人： | 刘芬菊;杜杰;俞家华;张昊文;尚增甫;张钰烁 | 申请（专利权）人： | 苏州大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/68;C12Q1/48;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257 | 代理人： | 杨明 |
| 地址： | 215000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 修复 非同源末端连接 细胞活力检测 化疗和放疗 不同基因 活性水平 活性抑制 基因定点 突变技术 细胞活力 药物处理 质粒转染 基因 观察 可用 增敏 突变 筛选 细胞 检测 发现 | ||
1.一种测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)采用TALEN技术或CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒；
(2)对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理，得到经抑制处理的哺乳动物细胞；所述哺乳动物细胞为293T细胞，所述非同源末端连接修复分子抑制剂为非同源末端连接修复分子DNA-PK的抑制剂NU7441和DNA-PKcssiRNA中的一种，且所述DNA-PKcs siRNA的基因序列为SEQ ID NO:5；
(3)将(2)中所得的哺乳动物细胞用含有6-硫代鸟嘌呤的DMEM培养基进行培养；
(4)在经(3)处理好的哺乳动物细胞中加入MTT溶液，待蓝色甲臜颗粒形成后用DMSO溶解，然后采用酶标仪测定其在OD570nm的吸光值。
2.根据权利要求1所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(1)中采用TALEN技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒时，所设计打靶基因的左臂识别序列为SEQ ID NO:1，设计打靶基因的右臂识别序列为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(1)中采用CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒时，所设计的靶点引物的正向引物序列为SEQ ID NO:3，所设计的靶点引物的反向引物序列为SEQ IDNO:4。
4.根据权利要求1所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(2)中对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理是指：将步骤(1)中构建所得的质粒转染293T细胞并对转染后的293T细胞采用非同源末端连接修复分子DNA-PK抑制剂NU7441处理。
5.根据权利要求4所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(2)中进行质粒转染的过程包括：将293T细胞接种在培养皿中，当该细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(1)中构建所得的质粒转染293T细胞。
6.根据权利要求1所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(2)中对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理是指：将步骤(1)中构建所得的质粒和DNA-PKcs siRNA共转染293T细胞。
7.根据权利要求6所述的测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：步骤(2)中进行质粒转染的过程包括：将293T细胞接种在培养皿中，当该细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(1)中构建所得的质粒和DNA-PKcs siRNA共转染293T细胞。
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