[发明专利]一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种筛选技术领域，尤其是一种基于原生质体诱变、深孔细胞培养板的高通量筛选衣康酸高产菌株的方法。

背景技术

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是世界上第五大有机酸。由于分子内存在一个不饱合双键和两个活泼的羧基,使得衣康酸能够进行加成、聚合反应,形成聚合高分子,其中尤其重要的是衣康酸的酯化反应。标准的酯化反应能够产生衣康酸二酯,且产率很高。衣康酸酯类是合成树脂、塑料、增塑剂的重要原料；另外,衣康酸与胺类反应生成的N-烃基吡咯烷酮是一类重要的化合物。衣康酸及其酯类是生产腈纶等化纤、合成树脂、塑料、橡胶、药物、表面活性剂、无毒食品包装材料、除草剂、除垢剂、粘着剂等工业原料,广泛用于化工行业。

衣康酸的生产方法有化学合成法、柠檬酸分解法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于原料来源广泛、成本低、生产条件温和，是目前国内外生产衣康酸的主要方法。在衣康酸的生产过程中，如何快速高效地获得高产菌株至关重要。目前，衣康酸生产菌种主要有属于土曲霉群的土曲霉(Asp.terreus)和属于灰绿曲霉群的衣康酸曲霉(Asp.itaconicus)。实际生产中应用最多的是土曲霉，但是Asp.terreus野生菌株一般产量都很低，因此运用诱变育种的方法来获得高产菌株的研究日益增加。而诱变后菌种筛选工作量巨大而效率非常低，是目前制约工业微生物生产发酵的重要因素。高通量筛选技术，由于具备微量、高效、灵敏、准确、可重复等特点，成为微生物筛选的主要技术手段。目前还未见适合筛选衣康酸高产突变株的高通量筛选方法的相关报道。

本研究旨在建立一种高效快速筛选衣康酸高产菌株的高通量筛选方法。通过诱变育种，结合高通量方法筛选衣康酸高产菌株，既可以提高工作效率，降低成本，又能大幅度提高筛选速率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株。

本发明的技术方案为：一种衣康酸高产菌株，为土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11039，保藏日期为2015年7月2日。

一种权利要求1所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，包括菌株的原生质体诱变；选择性平板初筛；基于深孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察，具体步骤为：第一步，菌株的原生质诱变：菌株培养后过滤渗透压稳定剂冲洗得到的菌丝体，收集菌丝体移入无菌三角瓶内加入酶液酶解，过滤去除菌丝片段，离心收集原生质体，渗透压稳定剂清洗后重悬于渗透压稳定剂中；然后对得到的原生质体进行诱变得到原生质体液；所述的原生质体诱变采用方法为紫外线诱变、DES诱变或者超声波诱变中的任一种；

第二步，选择性平板初筛：利用渗透压稳定剂配制再生培养基，上层平板液事先放入40～45℃水浴中保温，将原生质体液加入上层平板液混匀，快速倾倒在已凝固的下层再生平板上，倒置，培养箱温度35～37℃，培养3～5d；平板的筛选因素为：溴甲酚绿、高糖、代谢产物衣康酸或代谢前体琥珀酸中任意一种；

第三步，基于深孔细胞培养板的高通量筛选：挑取再生平板单菌落挑至装有1.2～2.0mL发酵培养基的深孔板中，在150～250r/min下，振荡培养2～4d，离心，取上清液测衣康酸含量，同时一一对应地接至装有固体斜面培养基的深孔板中，于25～28℃恒温培养3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根据测定结果挑选菌株进行摇瓶复筛；

第四步，摇瓶复筛及遗传稳定性考察：将挑选出要进行摇瓶复筛的菌株从斜面培养基中对应的菌落接种至含种子培养基的摇瓶中，摇床培养得到种液，进行摇瓶复筛；摇瓶复筛的条件为：接种量5％～10％，35～37℃，150～250r/min摇床培养3～5d；连续传代培养5代，考察遗传稳定性，筛选得到最稳定的菌株。

第一步中所述的酶液为：纤维素酶4～8mg/ml，蜗牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。

所述的渗透压稳定剂为0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。