[发明专利]一种基于深孔板的衣康酸高产菌株的高通量筛选方法及菌株

权利要求书

1.一种衣康酸高产菌株，其特征在于，为土曲霉(Aspergillusterreus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.11039，保藏日期为2015年7月2日。

2.一种权利要求1所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于：包括菌株的原生质体诱变；选择性平板初筛；基于深孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察，具体步骤为：第一步，菌株的原生质诱变：菌株培养后过滤渗透压稳定剂冲洗得到的菌丝体，收集菌丝体移入无菌三角瓶内加入酶液酶解，过滤去除菌丝片段，离心收集原生质体，渗透压稳定剂清洗后重悬于渗透压稳定剂中；然后对得到的原生质体进行诱变得到原生质体液；所述的原生质体诱变采用方法为紫外线诱变、DES诱变或者超声波诱变中的任一种；

第二步，选择性平板初筛：利用渗透压稳定剂配制再生培养基，上层平板液事先放入40～45℃水浴中保温，将原生质体液加入上层平板液混匀，快速倾倒在已凝固的下层再生平板上，倒置，培养箱温度35～37℃，培养3～5d；平板的筛选因素为：溴甲酚绿、高糖、代谢产物衣康酸或代谢前体琥珀酸中任意一种；

第三步，基于深孔细胞培养板的高通量筛选：挑取再生平板单菌落挑至装有1.2～2.0mL发酵培养基的深孔板中，在150～250r/min下，振荡培养2～4d，离心，取上清液测衣康酸含量，同时一一对应地接至装有固体斜面培养基的深孔板中，于25～28℃恒温培养3～5d,用板封口膜密封,4℃冰箱保存；根据测定结果挑选菌株进行摇瓶复筛；

第四步，摇瓶复筛及遗传稳定性考察：将挑选出要进行摇瓶复筛的菌株从斜面培养基中对应的菌落接种至含种子培养基的摇瓶中，摇床培养得到种液，进行摇瓶复筛；摇瓶复筛的条件为：接种量5％～10％，35～37℃，150～250r/min摇床培养3～5d；连续传代培养5代，考察遗传稳定性，筛选得到最稳定的菌株。

3.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第一步中所述的酶液为：纤维素酶4～8mg/ml，蜗牛酶2～4mg/ml，溶菌酶0.5～1.5mg/ml的混合酶。

4.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的渗透压稳定剂为0.4～0.65mol/L的NaCl水溶液。

5.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，第三步所述的发酵培养基配方为：葡萄糖60～100g/L，(NH₄)₂SO₄1～5g/L，MgSO₄.7H₂O1～3g/L，KH₂PO₄1～3g/L，FeSO₄·7H₂O0.02～0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O0.01～0.1g/L，玉米浆1～3g/L，调节pH3.0-3.5；固体斜面培养基配方为PDA培养基。

6.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的紫外线诱变法为：吸取单孢子悬浮液5～8mL，加入到放于磁力搅拌器上的直径9cm的培养皿中，在15～20cm的距离下用15～20W的紫外灯照射50～200s。边搅拌边照射，使孢子均匀的吸收紫外线光波。

7.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的DES诱变法为：用0.1～0.2mol/L的磷酸缓冲液，pH值5～8，分别配置体积分数为0.5～2.5％的DES溶液，各取以上DES溶液和菌悬液等量加入到无菌试管内混匀，室温振荡处理5～10min，诱变处理结束后加入0.5～1mL、1～2％wt的NaS₂O₃终止反应。

8.根据权利要求2所述的所述的衣康酸高产菌株的基于深孔板的高通量筛选方法，其特征在于，所述的超声波诱变法为：用移液枪移取2～4mL菌悬液，置于灭好菌的无菌离心管中，运用超声波细胞粉粹机,采用150～200W的功率，分别作用5～60min。