[发明专利]能扩增多种食品微生物的引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用全基因组生物信息分析技术优势，并用PCR扩增及sanger测序验证引物对的方法开发出能用于多种食品微生物检测的引物对及其应用。

背景技术

近年来，国内各地检测出饮用水菌落总数超标、各类食品细菌超标、冷饮大肠杆菌超标等，这一系列事件显示食品微生物超标问题已成为人们日常饮食安全的一大隐患，时刻威胁着人们的健康。德国专家称大肠疫情流行菌株可人际传染。因此，如何快速准确地检测食品中微生物是否达标已成为亟须解决的问题。

我国卫生部颁布了《食品微生物学检验方法微生物学部分GB4789－2010》，食品微生物检验在标准化的发展轨道上越走越严格，更大程度地保障了人民的健康。这套标准规定检查的食品微生物检测项有菌落总数、大肠菌群计数、金黄色葡萄球菌检验等。目前我国质检部门主要检验的是菌落总数、大肠菌群及致病菌3个项目。

目前对于食品微生物检测技术通常有琼脂平板培养法、显微镜镜检法、生化鉴定法等。而生物检测技术是近年来飞速发展，且在食品微生物检测中备受关注。应用较广泛的方法有酶联免疫吸附技术、PCR技术、生物传感器技术以及生物芯片技术等，每种技术都有其优缺点，其中主要缺点检测成本较高，周期较长，需要新的方法来检测食品微生物。随着荧光定量PCR、金标和测序技术的发展，成本逐渐降低，应用荧光定量PCR、金标、测序技术的方法检测肉质食品将成为可能，这些技术具有特异、结果精确、灵敏、专一、微量和快速等优点。目前市面上检测食品微生物的荧光定量PCR技术，采用了多对引物分别扩增不同的物种，相对成本偏高和操作复杂。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种能扩增多种食品微生物的引物对。提供的引物对共2对；每对引物都能够在同样条件下扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌这些常见微生物的序列。且同一对引物扩增出的序列微生物物种间存在一定的差异性。引物对可应用到食品微生物检测和微生物鉴定上。

本发明的另一目的在于提供所述的引物对的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明首先对大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)这五个菌种的基因组做了比对，筛选出了同源性大于75％且小于100％、长度大于300bp的区域。为了设计引物，从这些区域中过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数大于2个的序区域。然后从这些同源区域中设计引物，要求一对引物能扩增出各个菌种，且各个菌种的序列有一定差异。用设计的2对引物PCR扩增大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌五个菌种的基因组序列，琼脂糖凝胶电泳确定成功扩增出序列，然后sanger测序，得到DNA片段序列。分析各菌种扩增出的序列与原菌种基因组序列一致性，然后分析各菌种序列间同源性与差异性。确定扩增出的序列可以用来区分食品微生物的种类。

所述的引物对共2对，序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。

所述的DNA片段，序列如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：14所示。

本发明的引物对可应用并加速荧光定量PCR或高通量测序等食品检测试剂盒或方法的开发。本发明的创新在于目前还没查询到一对引物可以扩增以上五个菌种，并且保证物种之间的序列有差异。

所述的引物对在辅助进行食品微生物或菌种鉴定中的应用。

所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为辅助食品微生物或菌种鉴定。

所述的DNA片段在辅助进行食品微生物或菌种鉴定中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明采用生物信息技术优势开发出能扩增多种食品微生物的引物对，即1对引物可以扩增出5个菌种的目的片段，并且每个物种目的DNA片段有差异，能区分不同的菌种。简化的引物对可应用于食品微生物或菌种鉴定的荧光定量PCR或其他方法的试剂盒开发，可大大降低成本及简化操作。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1