[发明专利]一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法

说明书

本发明公开一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法，环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多点突变获得。制备方法：将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a(+)‑EH；采用滚环PCR扩增质粒pET28a(+)‑EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；将含有编码正确突变体的基因的PCR反应液转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒；转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明环氧化物水解酶具有极高的温度稳定性和pH值适应范围，可以大大提高工业化生产中环氧化物水解酶的使用寿命。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法。

背景技术

环氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.10)是催化水解环氧化物或其盐生成相应邻二醇或其盐的一类酶的总称，催化反应无需任何辅酶、辅基或金属离子的参与。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中。近年来，由于具有立体专一性好、酶促反应快、产物光学纯度和得率高，以及分离纯化产物较简单等优点，微生物来源的环氧化物水解酶受到了广泛关注和具体应用。1977年Miura等人首次成功将环氧化物水解酶应用于L(+)-酒石酸的工业化生产(US Patent4010072)。

L(+)-酒石酸，又名(2R,3R)-2,3-二羟基-1,4-丁二酸，是一种天然存在的有机酸，在食品行业中可以用作酸味剂，酒石酸单(双)酐酯是重要的食品添加剂；在医药行业中，它是最常用的手性药物和中间体的拆分剂；在印染业中作为防染剂、固色剂等；还可以作为金属离子隐蔽剂，用于电镀、制革和制镜等行业。

过去，生产L(+)-酒石酸的主要方法是提取并加工葡萄酒的副产物酒石，也可以以葡萄糖为主要原料通过发酵、转化和提取制备。目前，以顺丁烯二酐为原料，利用含有环氧化物水解酶的微生物转化是主要的生产方式。催化原理如下：先将顺丁烯二酐和过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，再利用微生物环氧化物水解酶将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或盐。

目前报道过的能生产用于L(+)-酒石酸制备的环氧化物水解酶的微生物有根瘤菌属、假单胞菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属、红球菌属、无色杆菌属、醋酸杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属和不动杆菌属。工业生产中常用的是具有较高催化效率的红球菌属。2007年Liu等首次报道了红球菌Rhodococcus opacus ML-0004环氧化物水解酶基因，并将其在原核细胞(E.coli)进行了表达。(Appl Microbiol Biotechnol 2007；74:99-106)然而该酶热稳定性极差，对温度特别敏感，在45℃下保存30min则会失去60％活力，在50℃保存30min后完全失活。弱热稳定性限制了生物催化剂的使用寿命，限制了其催化效率，也增加了工业生产中的成本。因此，提高此酶的热稳定性是目前利用生物催化法生产L(+)-酒石酸最重要的问题之一。

目前，通过基因工程手段改造蛋白质一级结构，增强蛋白质三维结构刚性来提高蛋白质热稳定性的手段已经成为主流。按照对蛋白质结构和功能关系的了解程度，蛋白质改造手段主要分为“定向进化”，“理性设计”和“半理性设计”。从上世纪80年代开始，“定向进化”已经成功地被应用到了蛋白质“体外改造”上。由于“定向进化”不需要了解特定蛋白质的结构和其相应的功能，建立起合理的进化筛选机制之后就可以模拟自然进化对目的蛋白质进行改造和筛选，因此大量结构刚性低而且结构信息少的蛋白质由此得到了改造(FEBS Lett.276(2009)1750–1761)。虽然效果显著，“定向进化”还是有着改造方向盲目、工作量大和筛选机制难以建立的缺点。