[发明专利]一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法

权利要求书

1.一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

1）配制实验试剂：（1）细胞培养液；（2）预冷的70%乙醇；（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）；（4）0.5%的TritonX-100；

2）细胞培养：CHO细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM 培养液中，放置于37 ℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

3）细胞染毒：将指数生长期的CHO细胞，按1×10⁶个/孔的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，进行细胞染毒，每个处理组设三个平行，染毒时间为24 h；

4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，具体步骤如下：

a、细胞提取：细胞染毒24 h后弃去染毒液，加入500 μL0.25%胰酶，消化1-2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次；

b、乙醇固定：准备70%的乙醇，-20℃预冷，在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于-20℃冰箱固定过夜；

c、TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次，加入0.5%的TritonX-100 100μL破膜；

d、加入FITC直标的Anti-H2AX 10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测；

e、流式细胞仪检测；

5）结果与分析：通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率：

。

2.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：实验试剂的配制方法如下：

（1）细胞培养液：DMEM 培养液+10%的胎牛血清（FBS）+100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 链霉素；

（2）预冷的70%乙醇：取无水乙醇70 mL，用去离子水定容至100 mL，混匀后放置于-20 ℃冰箱中预冷24 h；

（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2g KCL，0.2g KH₂PO₄，8g NaCL，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，加双蒸水至1L，PH 7.2～7.4，高压灭菌；

（4）0.5%的TritonX-100：取0.5 mL TritonX-100，加入99.5 mL的PBS，37℃水浴震荡至溶解。

3.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：所述染毒毒素为卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺NNK、杂环胺AαC。

4.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：流式细胞仪参数设置：设置激发光：488 nm；检测发射光通道：SYTOX荧光：FL1 channel:530/30 band-pass filter；EMA荧光：FL3 channel:670 long-pass filter。