[发明专利]一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法

权利要求书

1.一种基于尿中本胆烷醇酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，其特征在于，包括：

取尿样6mL，加入1mL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液和50μLβ-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3小时，取出，加入8mL叔丁基甲醚振荡萃取，离心，吸取上层有机溶液，在65℃加热的情况下用氮气吹干，再用50μL 100％乙腈溶剂溶解，转入样品瓶中，封盖，以HPLC纯化，收集24-25分钟含有本胆烷醇酮的流出液1mL，取50μL的流出液，在60℃加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得本胆烷醇酮的δ₁值，余下的流出液在60℃加热的情况下用氮气吹干，得本胆烷醇酮，其中，所述HPLC纯化的步骤为：进样量为45μL，色谱柱为ZORBAX SB-C18，规格为4.6mm×250mm×5μm，流动相为乙腈-水系统，洗脱起始流动相体积比为：30％乙腈-70％水，等梯度洗脱，于40分钟内完成至流动相为100％乙腈，流速为1mL/min；

取上述制备的本胆烷醇酮，加入4μL冰醋酸及16μL氧化剂，在68℃保持1小时，再升温至90℃保持1小时，得反应液，反应液用50μL CH₂Cl₂提取两次,合并提取液，提取液用氮气吹干后，加入20mg无水碳酸钠及10μL醋酐，在120℃保持2.5小时后，用氮气吹干，再加入超纯水分散残渣，用50μL CH₂Cl₂提取，有机层在60℃加热的情况下用氮气吹干，得到A-nor-5β-androstane-2,17-dione，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ₂值，其中，所述氧化剂由13.5g的铬酐、500mL的H₂O和40mL质量浓度70％的H₂SO₄组成；

考察本胆烷醇酮的δ₁值与A-nor-5β-androstane-2,17-dione的δ₂值，如δ₁-δ₂的差值大于2.8‰，则表明尿样为使用新型睾酮兴奋剂的尿样。