[发明专利]用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒，以及其制备方法。

背景技术

目前用于抗体检测的方法主要有胶体金法、免疫层析法、荧光PCR法、免疫荧光法或间接免疫荧光法、酶联免疫斑点法。胶体金法是一种常见的标记技术，它是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，对抗原抗体进行定性及半定量研究的标记技术，因其具有操作快速简便、特异敏感、稳定性强、价格低廉等优点，已在临床检验和其他领域取得广泛的应用，但是胶体金法只能进行定性或半定量检测，准确性较差，容易漏检弱阳性样本。免疫层析法是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断，免疫层析法虽然操作简单，不需要特殊的仪器设备，但是层析材料的选择和处理比较困难。荧光PCR法是比较定性、规范的一种方法，比较容易判断，但是该方法敏感性差，较易出现假阳性的现象；免疫荧光法或间接免疫荧光法虽然其检测特异性强、敏感性高、速度快但是其需要价格昂贵的免疫荧光显微镜，工作人员需具有一定的经验，技术程序也还比较复杂；酶联免疫斑点法是基于ELISA试验发展起来的,即可从单细胞水平检测抗体分泌细胞,又可以检测分泌量的一种细胞免疫学检测技术，其原理是用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来，酶联免疫斑点法虽然检测灵敏度较高，但是其操作费时，需要严密控制试验条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够快速检测一项或多项病原体抗体的方法，利用本方法所制备的试剂盒，方法简便，用时较短，检测高效准确，不易出现漏检情况，还能消除干扰因素对检测结果的假阳性干扰，并能使酶标抗体的过程更加快速高效，同时延长试剂盒的有效期。

为解决上述技术问题，本发明方法的技术方案是：利用抗原抗体反应，使抗原或二抗固相化于硝酸纤维素膜上，当血清标本由于渗滤作用通过硝酸纤维素膜时，其中的病原体IgM（IgG）抗体便与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，而其他无关物质则被滤过，再加上酶标抗体或酶标抗原，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合，然后加入显色液显色产生肉眼即可方便观察的紫色印迹。

其中，所述酶标抗体或酶标抗原工作液的配制方法分为两部分，包括酶标抗体或酶标抗原的配制方法，及酶标抗体或酶标抗原的稳定稀释缓冲液的配制方法；

所述酶标抗体或酶标抗原的配制方法，采用以下步骤制备：

（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；

（3）将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

（4）加入1mg左右的抗体或抗原溶液，并于室温下反应25～35min；

（5）使步骤（4）制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标抗体或抗原溶液；

所述酶标抗体或抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：

褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物；