[发明专利]用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是，检测方法如下：

（1）加入待检血清标本，使待检血清标本通过膜；

（2）病原体IgM（IgG）抗体与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，加入洗涤液，其他无关物质则被滤过；

（3）加上酶标抗体或酶标抗原工作液，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合；

（4）加入显色液显色；

（5）加入终止液，进行结果判读。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。

3.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：步骤（3）中所使用的酶标抗体或酶标抗原工作液的配制方法分为两部分，包括酶标抗体或酶标抗原的配制方法，及酶标抗体或酶标抗原的稳定稀释缓冲液的配制方法；

所述酶标抗体或酶标抗原的配制方法，采用以下步骤制备：

⑴将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

⑵将步骤⑴制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；

⑶将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

⑷加入1mg左右的抗体或抗原溶液，并于室温下反应25～35min；

⑸使步骤⑷制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标抗体或抗原溶液；

所述酶标抗体或抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：

⑴褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物；

⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。

4.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述洗涤液的配置方法为，在配置成0.01M的Tris-HCl缓冲液中加入5.0g曲拉通X-100、0.2gNaCl、0.2gNaN₃和一定量的BSA，加水至1000ml，振荡均匀即为所需的洗涤液。

5.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述显色液包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系。

6.根据权利要求5所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述显色液采用如下方法制得：

将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；

再将0.8～0.83g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；

将上述两种溶液混合，振荡混匀；

分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.4～0.6g过氧化脲加入到步骤所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。