[发明专利]一种无DMSO的冷冻保护剂与冷冻保存卵巢的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术低温医学领域，特别涉及一种无DMSO的冷冻保护剂，还涉及使用此冷冻保护剂的冷冻保存卵巢的方法。

背景技术

随着诊断及治疗手段的进步，生育期女性癌症患者的生存率显著提升。但是，癌症治疗手段（如放化疗）可能造成卵巢功能下降甚至衰竭。卵巢皮质组织深低温冻存现已作为放化疗前保存生育力的方法应用于临床，但受限于移植后组织缺血损伤以及大量卵泡损失，而完整卵巢移植通过吻合血管可恢复血供，理论上能够克服这个难题，现已有羊完整卵巢冻融后移植并分娩小羊的报道。

完整卵巢冷冻与皮质冷冻相似，常采用二甲基亚砜(DMSO)、甘油、动物血清等冷冻保护剂，但冷冻保护剂的渗透及去除较皮质块更困难，特别是DMSO，在4℃以上具有细胞毒性。因此，研究一种无毒且细胞存活率高的冷冻保护剂，就成为卵巢冷冻领域亟待解决的一个问题。海藻糖具有无毒性及保存细胞活性，已成为近年冷冻保护剂领域研究热点。

发明内容

为了解决以上现有技术中冷冻保护剂有毒性、渗透及去除困难的问题，本发明公开了一种不含DMSO的无毒、易去除、能较好保存组织学形态的无DMSO的冷冻保护剂。

本发明还提供了使用上述无DMSO的冷冻保护剂冷冻保存卵巢的方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种无DMSO的冷冻保护剂，含有以下组分：

海藻糖200mmol/l，PVP400.3g/mL，胆固醇200ug/l，卵磷脂200ug/l。

所述的冷冻保护剂，还含有胎牛血清0.1g/mL和RMPI-1640。

所述的冷冻保护剂，将海藻糖、PVP40、胆固醇、卵磷脂、胎牛血清（FBS）、RMPI-1640混合制成无菌悬浊液。

一种冷冻保存卵巢的方法，包括以下步骤：

（1）灌注：对新采摘卵巢，通过卵巢动脉插管并行丝线固定，结扎卵巢动脉分支后，与灌注装置相连，启动装置以0.5-5mL/min的速率，向卵巢灌注权利要求1-3中任一项所述的冷冻保护剂，灌注时长共计10-60min；

（2）冻存：灌注后，将卵巢表面任何肉眼可见的卵泡穿刺，抽吸去除内容物，然后将卵巢放入装有相应权利要求1-3中任一项所述的冷冻保护液的冷冻袋中，进行降温，设定为①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min，随后投入液氮中存放。

所述的方法，步骤（1）中灌注速率为1.3mL/min，灌注时长30min。

所述的方法，所述卵巢为羊卵巢。

本发明的有益效果：

1）本发明的冷冻保护剂不含有DMSO，无细胞毒性，易去除，原料易得，制备简单，冷冻保护效果好，正常形态原始卵泡比率高，细胞凋亡数量少；

2）本发明的冷冻保存卵巢的方法，简单易操作，冷冻保存效果好，对羊卵巢整体冻存后可较好保存组织学形态。

附图说明

图1冻融后羊卵巢皮质区内典型的正常形态及异常形态的原始卵泡，

（A）（→处）示正常形态原始卵泡，球形卵母细胞，细胞核完整且核仁清晰，周围被均匀分布的颗粒细胞包绕。Bar=100μm（B）（→处）示异常形态卵泡，胞浆内含有空泡（↓处），周围颗粒细胞排列紊乱，Bar=100μm.；

图2(A)光镜下各组羊卵巢髓质区域代表性图片（HE染色）Bar=100μm，(B)各组基质细胞图像计数量化分析^*表示与新鲜对照组比较P<0.05；

图3(A)各组TUNEL反应阳性的细胞代表性图片，蓝色为细胞核被DAPI染色，绿色为凋亡细胞被TUNEL标记显色，Bar=100μm；(B)各组TUNEL反应阳性的细胞图像量化分析^*表示与新鲜对照组比较P<0.05，△表示与海藻糖组比较P<0.05；

图4BAX基因和CIRP基因mRNA在各组中的表达。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的配方原理及制备方法做进一步的说明。下述实施例以羊卵巢为例。

实施例1冷冻保护剂配方的筛选