[发明专利]一种宝兴百合组培快繁和离体保存方法

权利要求书

1.宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，所述的宝兴百合的组培快繁是取宝兴百合的中层鳞片进行消毒后，接种在不定芽诱导和增殖培养基上，获得小鳞茎后，转接到使鳞茎增大及生根的培养基中，经过炼苗处理后，移栽；所述的宝兴百合的离体保存是去除长根且增大的鳞茎的根和叶，置于离体保存培养基中，在低温条件下培养，离体保存周期可延长至4年。

2.根据权利要求1所述的宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，其特征在于所述的方法中，不定芽诱导和增殖培养基为(1)：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；使鳞茎增大及生根培养基为(2)：MS+PPP₃₃₃2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；离体保存培养基为(3)：MS+PPP₃₃₃0.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L；以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L；所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m²·s)，光照12h/d。

3.根据权利要求1所述的宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，其特征在于所述的宝兴百合的组培快繁方法中，取野生宝兴百合的鳞茎，洗净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min后，用流动自来水冲洗30-40min，再用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％HgCl₂水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，将鳞片接种至不定芽诱导培养基MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L中，待长出愈伤组织，出现芽分化，长出新叶片后，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次；将新增殖的鳞茎转接在生根培养基MS+PPP₃₃₃2.0mg/L+NAA0.5mg/L，培养15天，长根后，在此培养基中继续培养，待鳞茎增大至直径1.5-2.0cm，将已生根增大的鳞茎去除根叶，转至培养基MS+PPP₃₃₃0.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L中，培养瓶口用保鲜膜封严，在培养温度为13±2℃条件下，继代周期延长至4年以上；将生根3-6条、根长为1-2cm的小苗炼苗处理后，移栽至经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1的基质中。

4.宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，包括获取外植体、诱导不定芽与增殖培养、鳞茎增大及生根培养、离体保存、移栽步骤，其特征在于该方法的培养条件为：(1)不定芽诱导和增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；(2)鳞茎增大及生根培养基：MS+PPP₃₃₃2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；(3)离体保存培养基：MS+PPP₃₃₃0.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L，以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L，所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m²·s)，光照12h/d；

所述的获取外植体步骤是取野生宝兴百合的鳞茎，洗净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min，再用流动自来水冲洗30-40min以清除鳞片表面杂质。将经过初步清洗的鳞片用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl₂水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去已经损伤的组织待用；

所述的诱导不定芽与增殖培养步骤是将鳞片接种至不定芽诱导培养基(1)上，每瓶接种5个外植体；待长出愈伤组织，出现芽分化，长出新叶片后，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次，增值率可达1∶10；

所述的鳞茎增大及生根培养是将新增殖的鳞茎转接在培养基(2)上，每瓶接种5个，培养15天，长根4条以上，生根率100％；在此培养基中继续培养，在诱导生根的同时鳞茎增大至直径达1.5-2.0cm；

所述的离体保存步骤是将生根且增大的鳞茎去除根叶，转至培养基(3)中，每瓶接种5个，培养瓶口用保鲜膜缠绕6圈以上封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，培养条件调整为13±2℃，光照强度为10μmol/(m²·s)，光照12h/d，继代周期可延长至4年以上；

所述的移栽步骤是当宝兴百合鳞茎生根达4条以上，根长为1-2cm时，先将瓶苗放在大棚内炼苗2天，后半开盖炼苗5天，然后进行移栽；移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1，栽好后浇透定根水，先期用塑料薄膜覆盖保湿，视苗生长状况进行及时通风以防过湿霉变，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率达90％以上。