[发明专利]培养原代海马神经元的方法

权利要求书

1.一种用于膜片钳实验的原代海马神经元的培养方法，其特征在于，包括：

(1)将海马组织进行消化处理，以便获得经过消化处理的海马组织；

(2)将所述经过消化处理的海马组织进行吹打分散处理，并加入第一培养液，重悬细胞，以便获得细胞悬液；

(3)将所述细胞悬液接种至多聚赖氨酸包被的培养皿中，进行第一培养2-4小时，使细胞贴壁，其中细胞接种密度为3～7×10⁵/ml；

(4)将所述培养皿中的所述第一培养液更换为第二培养液，然后进行第二培养24小时；

(5)向所述培养皿中添加1～2μg/ml的阿糖胞苷，然后进行第三培养24小时；

(6)利用所述第二培养液对所述培养皿进行半量换液，然后进行第四培养至少3天，按照每周半量换液2次的频率进行换液，以便获得原代海马神经元；

步骤(1)进一步包括：

将所述海马组织切成1～2mm³的组织块；

于37℃下，利用0.25％的胰蛋白酶液将所述组织块进行消化处理20分钟；以及

利用胎牛血清终止消化；

所述半量换液是按照以下步骤进行的：

将培养皿中的废弃培养基吸入至离心管中，进行第三离心，并收集第三上清；

利用第二培养液对培养皿中的细胞进行洗涤；以及

向所述培养皿中分别加入第二培养液和所述第三上清，其中所述第二培养液和所述第三上清的添加量均为所述培养皿中所述废弃培养基体积的1/2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海马组织是以温度为4摄氏度的DMEM培养基为解剖液，从离体非人哺乳动物大脑中剥离获得的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为大鼠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：

a、将所述经过消化处理的海马组织进行吹打，每吹打10次后吸取上层悬液，然后利用200目细胞过滤网将所述上层悬液进行过滤，收集滤液；

b、向所述滤液中添加所述第一培养液，然后重复步骤a不超过3次；

c、收集最终滤液，并进行第一离心，弃上清并用所述第一培养液将沉淀进行吹打洗涤，然后进行第二离心，弃上清并向沉淀中添加所述第一培养液，吹打制备成细胞悬液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一离心和所述第二离心均是于1000rpm/min条件下进行2～5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养、第二培养、第三培养和第四培养均是在37℃，5％CO₂的条件下进行的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后和步骤(3)之前，进一步包括：

预先利用所述第一培养液将所述细胞悬液稀释至3～7×10⁵/ml的密度。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述第一培养3小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，按照每3～7×10⁵细胞采用2ml所述第二培养液的比例，将所述培养皿中的所述第一培养液更换为第二培养液。