[发明专利]一种焦磷酸测序文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序文库的构建方法。

背景技术

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作，这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。焦磷酸测序技术是由3种或4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在几种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

现有技术中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库。采用本发明的构建高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。现有技术还存在建库效率较低，试剂、样品损耗大，信息不完整的问题，需要构建新方法来解决。

发明内容

本发明的一个目的是一种焦磷酸测序文库的构建方法，包括以下步骤:

（1）    样品DNA提取及定量；

（2）DNA片段化、纯化及片段选择：DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择；

（3）    末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；

（4） Y接头连接：接头包括正向接头和反向接头，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；

（5）    在接头上设计多个标签，可以一次处理多个样品；

（6）    小片段去除；

（8）PCR 扩增，获得扩增产物，即为双链DNA文库；

（9）变性为单链，使双链DNA文库变为焦磷酸测序文库。

所述回收为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收或Double SPRI方法回收，优选为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收。

所述接头为接头a:

正向接头：5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′，

反向接头：3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp5′。

    所述接头a的标签为GCATCACT和CGTAGTGA。

所述接头为接头b:

正向接头：5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT 3′，

反向接头：3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。

所述接头b的标签为TCACTAGT和AGTGATCT。

所述的标签为96个。

所述定量使用Qubit荧光仪，定量检测的标准为50μg/μl以上。

所述DNA片段化使用Covaris超声波打断仪。

所述目的片段的纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒。

所述小片段去除使用磁珠纯化法，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上。

所述PCR 扩增的扩增混合液中包含Mn²⁺和Mg²⁺，Mn²⁺的浓度为0.60-1.10 mmol/L，Mg²⁺的浓度为0.80-1.20mmol/L。

所述变性的温度为93-95℃，时间为3分钟以上，优选为3-5分钟。

所述小片段去除使用磁珠纯化法，所述磁珠为AMPure磁珠。