[发明专利]一种焦磷酸测序文库的构建方法有效
| 申请号： | 201510414230.7 | 申请日： | 2015-07-15 |
| 公开（公告）号： | CN104962551A | 公开（公告）日： | 2015-10-07 |
| 发明（设计）人： | 高静;蔡亦梅;徐潇;吴超;张睿;王者馥;王绪敏;殷金龙;任鲁风 | 申请（专利权）人： | 北京中科紫鑫科技有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06 |
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| 地址： | 101111 北京市大兴区经济技术开发区科创六街*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 磷酸 序文 构建 方法 | ||
1.一种焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品DNA提取及定量；
DNA片段化、纯化及片段选择：DNA片段化，进行目的片段的纯化、回收，片段的定量和选择；
末端补平，加A尾：对DNA进行末端补平，在3’端加A尾；
Y接头连接：接头包括正向接头和反向接头，正向接头和反向接头退火形成一个部分互补配对的Y型接头；
在接头上设计多个标签，可以一次处理多个样品；
小片段去除；
PCR 扩增，获得扩增产物，即为双链DNA文库；
（8） 变性为单链，使双链DNA文库变为焦磷酸测序文库。
2.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述回收为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收或Double SPRI方法回收，优选为2.5%琼脂糖凝胶电泳胶回收。
3.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述的标签为96个。
4.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述定量使用Qubit荧光仪，定量检测的标准为50μg/μl以上。
5.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述DNA片段化使用Covaris超声波打断仪。
6.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述目的片段的纯化采用Qiagen PCR纯化试剂盒。
7.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述小片段去除使用磁珠纯化法，磁珠纯化后的DNA，A260/A280的比值在1.85以上。
8.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述PCR 扩增的扩增混合液中包含Mn2+和Mg2+，Mn2+的浓度为0.60-1.10 mmol/L，Mg2+的浓度为0.80-1.20mmol/L。
9.如权利要求1所述的焦磷酸测序文库的构建方法，其特征在于，所述变性的温度为93-95℃，时间为3分钟以上，优选为3-5分钟。
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