[发明专利]高通量转录组文库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是基于分子生物学的基因组学检测技术，提供了一种高通量测序转录组文库构建方法。

背景技术

转录组是特定物种、组织或细胞类型转录的所有RNA(转录本)的集合。通过比较转录组或基因表达谱的研究以揭示生物学现象或疾病发生的分子机制是高通量组学研究的一个常用策略。利用高通量测序技术研究转录组在全面快速得到基因表达谱变化的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的cSNP(编码序列单核苷酸多态性)、可变剪接等序列及结构变异，另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势。目前转录组的研究方法主要包括基因芯片和二代测序，而基因芯片只能对已知物种的转录组学研究，而二代测序则可以对已知和未知物种都可以做转录组学研究，基于第二代测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。

转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。

而转录组文库的构建，传统方法较为繁琐，步骤包括mRNA的分离，mRNA片段化，逆转录成cDNA，双链合成，末端补齐，末尾加A，加接头，PCR富集等步骤。同时对RNA的起始量也有较高的要求，一般要求微克级别的总RNA。因此，在一定条件下限定了转录组的应用，特别在一些单细胞转录组学研究，传统技术无法通过如此少量的RNA中构建文库。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高通量转录组文库的构建方法，采用本发明的方法RNA起始量可以做到ng级别，操作步骤比传统方法更简便。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量转录组文库构建方法(如图1所示)：

逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的引物，

所述特异性引物为：3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAG AAGGCTAGA--5'。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的改进：

PCR富集时所用的两段特异性引物为：

引物F：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCT3’；

备注说明：其中斜体加下划线部分与“逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物中的其中一段”互补；

引物R：

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCA3’。

备注说明：其中斜体加下划线部分与“逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物中的其中一段”相同，小写且下划线部分为高通量测序时用的barcode序列。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：

滚环扩增中所用的引物为：

RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc

RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进，该方法包括以下步骤：

1)、mRNA的分离：

从总RNA中分离mRNA；

2)、mRNA的片段化：

将mRNA打碎成片段(为约180-300bp的片段)；

3)、对片段化后的mRNA加poly A尾：

利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3’端加上碱基A(约为20-50个碱基A)；

4)、逆转录生成单链cDNA：

设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物(即，上文中所述的逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物)，与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链cDNA；

5)、单链cDNA的环化：

在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环；

6)、PCR富集，文库构建：

利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物(即，上文中所述的PCR富集时所用的两段特异性引物)，通过一轮PCR，制备转录组文库。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：

在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增：