[发明专利]一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取乳过氧化物酶的方法，特别涉及一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，本发明属于乳过氧化物酶的提取制备技术领域。

背景技术

乳过氧化物酶(lactoperoxidase，以下简称LP)是动物乳中分泌的一种氧化还原酶，并在保护哺乳期乳腺和预防新生婴儿的肠道病原微生物扮演着一个重要的角色，LP能够催化内源的硫氰酸盐(SCN-)氧化成具有抗菌性的硫氰酸盐(OSCN-)。牛乳中存在的乳过氧化物酶，它能够使卤化物氧化或在过氧化氢存在下氧化硫氰酸盐而形成抗菌介质。乳过氧化物酶携带Fe³⁺-血红素蛋白，它存在于哺乳动物生物液体，如牛奶，唾液和眼泪中。LP分子量为85kDa，等电点为8.0-8.5，在pH值为6.5时LP带正点，其在乳清中的含量为10-30mg/L。

乳过氧化物酶体系在食品行业中应用最广泛的是乳制品，在过去几十年里国内外有大量从乳中提取LP的方法有色谱技术、膜色谱等，色谱技术应用有离子交换，分子筛，免疫亲和色谱，膜色谱应用较多的是离子交换吸附膜。虽然传统这些色谱法提取LP纯度较高，但是仍有很多缺点例如耗时较长，回收率较低及成本昂贵，并不适宜大量生产乳过氧化物酶。想要高效率的从牛乳清中提取LP并不是一个简单的任务，因为乳清中存在大量的杂蛋白给分离带来了困难，因此从乳清中分离LP迫切的需要一个效率高、成本低、开发潜力大的方法。

盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法,其原理是在高浓度的盐溶液中,大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质水化作用减弱，相互凝聚沉淀出来，由于蛋白质水化作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物化常数有关，所以不同蛋白质在不同盐析条件下的析出程度也不同，从而达到分离目的。盐析法具有成本低、不需要昂贵设备、操作简单安全等特点，适用范围十分广泛。国内有关于用硫酸盐析法分离大豆酸沉蛋白和羔羊皱胃酶的报道，但是还没有报道用其分离乳过氧化物酶的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高回收率和纯化倍数可用于食品工业的乳过氧化物酶提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

以牛乳清为原料，以硫酸铵盐析法为提取手段，确定硫酸铵盐析法中最佳盐析条件下饱和度、盐析时间、最佳转速、体系pH的工艺条件，并比较了硫酸铵盐分级沉淀与直接一次用65％硫酸铵饱和度对LP酶活回收率和纯化倍数的影响。采用超滤技术进行进一步纯化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清→硫酸铵盐析法分级沉淀提取乳过氧化酶→沉淀溶解→溶液使用超滤分离→收集截留溶液→透析脱盐→冷冻干燥→乳过氧化物酶粗产品。

具体的，本发明的一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，包含以下步骤：

(1)硫酸铵盐析法分级提取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中添加25-85％饱和度的硫酸铵，离心，去除沉淀，置于搅拌器上不断搅拌使硫酸铵充分溶解，调节体系pH到5.5-8.5，放置2-10h使乳过氧化物酶完全沉淀，4℃5000-10000r/min离心20min到沉淀即为乳过氧化物酶制品；

(2)超滤：

将步骤(1)中得到的沉淀使用适量去离子水复溶用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋白，收集截留溶液；

(3)脱盐处理：

将步骤(2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；

(4)干燥：

将步骤(3)脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)中使用硫酸铵饱和度为65％。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)中使用硫酸铵分级沉淀盐析，具体为使用先用饱和度25-35％的硫酸铵盐析，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为55-70％。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)中使用先用饱和度30％的硫酸铵盐析，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为65％。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)中离心转速使用7000r/min。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)中硫酸铵盐析时间为8h。

在本发明中，优选的，所述步骤(1)盐析体系pH为6.5。

在本发明中，优选的，所述步骤(2)中使用分子量30-50kDa的超滤膜进行超滤分离，以除去部分分子量小于30-50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的。