[发明专利]嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)广泛存在于自然界的淡水、污水和土壤中，通过污染的水和相关产品感染人类。临床症状表现为胃肠炎，皮肤和软组织感染，也是淡水养殖较为严重的病原菌之一。会导致鱼类的出血性败血症、积水、溃疡、无症状败血症和眼球突出等。此菌存在有多种血清型，随地域和宿主的不同而有所差异，限制了灭活疫苗的使用范围。解决此问题的关键在于找出嗜水气单胞菌的共同保护性抗原，以制备对不同血清型菌株均有保护作用的疫苗。外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。它镶嵌于细菌外膜的中间，在维持细菌外膜结构、物质转运方面发挥着重要作用。有许多研究结果表明，细菌的主要外膜蛋白的免疫原性很强，是重要的保护性抗原，ompA蛋白族是革兰氏阴性菌外膜中的主要成分并且是保守的，其主要作用是维持外膜的完整。缺少ompA和胞壁脂蛋白的细菌变异株其形态为球形，细胞膜也不稳定。健康的动物具有抵抗病原微生物的侵袭和感染的能力，机体可依靠皮肤、粘膜、血脑等屏障结构阻止病原微生物的进入，还可通过组织和体液中的抗微生物物质如补体、溶菌酶、干扰素等进行抑菌、杀菌或溶菌，机体这一系列的免疫反应限制或抵制了细菌的复制。因此，病原菌的致病作用必须能够逃避或适应宿主的防御，许多研究已证实，某些细菌的OMP在细菌致病过程中起着重要的作用。用SDS-PAGE分析了致禽败血症的大肠埃希氏菌OMP，发现禽大肠埃希氏菌非致病或表现很髙LD₅₀的菌株都缺乏仅在致病菌株中才有的40.7和28.8KD的2种主要蛋白亚单位，说明这2种蛋白可能在禽败血症的致病过程中起作用，因此，利用致病菌的OMP做免疫原可使鱼免受产生对不同血清型菌株感染的交叉保护力。

鱼类的非特异性防御机制可以分为体液防御和细胞防御两种方式，并且这两种方式都是先天形成的，没有特异性能，作用于所有的外来病原微生物、也无遗传性和记忆性。其中溶菌酶、补体和巨噬细胞呼吸暴发活性是评价鱼类非特异性免疫防御的重要指标。

由此可见，能否利用嗜水气单胞菌外膜蛋白基因进行原核表达从而制备一种蛋白，使其可作为对鱼具有保护作用的疫苗，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用。

本发明的技术方案包括：

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述蛋白将外膜蛋白基因片段克隆入原核表达载体pET-30a得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌获得重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，经纯化后获得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白可作为抗原在制备预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂中使用。

所述预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂还包括弗式不完全佐剂。

所述弗式不完全佐剂与所述嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白体积比为1:1。

所述的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂的制备方法包括以下步骤：在无菌注射器中加入制备好的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，用移液器向所述无菌注射器中加入等体积的弗式不完全佐剂，乳化5min后，用注射器反复推进，直至水相与油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色液滴，即制成疫苗制剂。

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：嗜水气单胞菌基因组DNA提取及嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆：从嗜水气单胞菌分离株提取基因组DNA，根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，将得到的PCR扩增产物纯化后，以载体和插入片段物质的量之比1：3的比例克隆入pMD18-T载体，在含氨苄青霉素的LB平板上挑取阳性克隆，经双酶切和PCR鉴定后，获得阳性克隆提取质粒DNA；