[发明专利]自组织化重组透明颤菌血红蛋白及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白及其基因在基因工程产品生产中的应用。

背景技术

随着细胞生物学以及生物工程技术在微生物、植物、动物领域的应用，利用基因工程技术已经可以生产、改良甚至构建具有目的功能或者生产目的基因工程产品，基因工程产品的生产已经取得了巨大的成功。

基因工程技术结合对宿主细胞代谢合成途径的认知，利用基因工程技术可以实现宿主生物质促进生产、目的基因工程产品促进生产、目的次级代谢产物促进生产。

在基因工程产品生产中，通过基因工程技术将目的基因与载体在体外连接后转入受体宿主细胞，使外源基因在宿主细胞中稳定表达并遗传。

以抗生素等次级代谢产物为代表的基因工程产品在生产过程往往受到氧供给的限制，氧需要通过溶解、传递等环节才能被宿主细胞利用，氧自身在水溶液中的溶解度有限，为提高氧的供给能力，需要通过增加通气量、加快搅拌速度等办法来增加溶氧，这使得基因工程产品生产成为高能耗产业。随基因工程技术的发展，利用基因工程技术改良宿主氧获得能力，降低基因工程产品生产能耗，提高基因工程产品产量成为可能。目前，VHb已经应用于发酵、重组蛋白表达、次级代谢产品表达、转基因动物、转基因植物和环保领域，取得了显著成效。

透明颤菌血红蛋白(vitroeoscilla hemoglobin,VHb)是目前研究较为深入的原核生物血红蛋白，VHb是由两个相同亚基构成的同型二聚体蛋白，每个亚基含有146个氨基酸残基和一个b型血红素分子。VHb具有很强的氧结合能力和非常迅速的氧释放能力，在基因工程产品生产中往往作为辅助蛋白使用，提高宿主菌的氧俘获能力。

在氧浓度较低(溶氧低于5％大气饱和度)的情况下，VHb受到其天然启动子的诱导表达，研究表明，当VHb在宿主细胞中表达时，宿主细胞的tRNAs和核糖体含量有所提高，宿主细胞的呼吸活性和ATP含量也有所增加。Khosla等(Nature,1988,331,633-635)提出，在低氧条件下，VHb血红蛋白能够大量积累，一部分VHb以活性的氧合蛋白形式存在，加速氧在低氧条件下向胞内传递，构造一个有机体可直接利用的蓄氧仓库，氧合血红蛋白能提高氧在呼吸链上的传递效率，加快了质子传递，促进了ATP的合成，提高了整个能量代谢水平。

Ramandeep(J.Biol.Chem.2001,276,24781–24789)研究表明VHb在大肠杆菌中表达时存在质膜结合和胞质表达两种模式，Rinaldi指出质膜结合形式的VHb起到氧俘获功能(Biochemistry 2006,45,4069-4076)，Anand指出胞质表达VHb起到氧感受器的功能，感受宿主细胞内的氧化压力，当宿主细胞内氧化压力增加时抑制VHb蛋白的表达(Biochem J.2010,426,271-280)。相比而言，质膜结合型的VHb对宿主细胞的氧供给能力有着更为重要的作用。

为提高VHb对宿主细胞的促进效果，对VHb的密码子偏好性改造、定点突变、易错PCR(error-prone PCR)改造、DNA改组(DNA shuffling)改造已经广泛展开，这些工作的进行进一步加深了对VHb生物工程和结构关系的理解，Isarankura-Na-Ayudhya指出对VHb自身结构的改造会引发该蛋白功能的较大变化(J microbiol biotechnol 2010,20,532-541；J.Biosci.Bioeng.2010,110,633-637；Int J biol Sci.2008,4,71-80)。

这种情况下，在保留VHb自身结构稳定的前提下，在VHb功能结构域之外引入自组织化多肽序列构建新的重组蛋白，利用自组织化片段间的相互识别和相互作用，改变重组蛋白的组装和宿主细胞内的分布形式，进而影响宿主的氧俘获和氧储存能力就成为一种新的VHb蛋白结构改造方法。

自组织化是蛋白质的一种特殊的组装方式，自组织化是通过多肽序列间直接的弱相互作用进行识别和组装的，自组织化后的蛋白质自组装体呈现出较强的质膜结合能力。自组织化多肽序列可以通过基因工程技术拼接到不同的重组蛋白内，诱导重组蛋白实现自组织化。至今未见利用自组织化片段重组技术，改进重组透明颤菌血红蛋白的质膜结合能力的研究

发明内容