[发明专利]分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1、由该细胞株分泌的单克隆抗体及应用在审

专利信息
申请号: 201510333160.2 申请日: 2015-06-16
公开(公告)号: CN104962524A 公开(公告)日: 2015-10-07
发明(设计)人: 蔡雪辉;王淑杰;刘鹤;刘永刚 申请(专利权)人: 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
主分类号: C12N5/20 分类号: C12N5/20;C07K16/08;G01N33/577;G01N33/569
代理公司: 哈尔滨龙科专利代理有限公司 23206 代理人: 高媛
地址: 150001 黑龙*** 国省代码: 黑龙江;23
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摘要:
搜索关键词: 分泌 cav 单克隆抗体 杂交瘤 细胞株 c1 应用
【说明书】:

技术领域

发明属于生物技术领域,涉及一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由该细胞株分泌的单克隆抗体及其应用。

背景技术

腺病毒(Canln adenovll.us,CAV)是迄今为止在形态结构、基因复制机理等生物学特性方面研究得最为详尽的病毒之一。腺病毒衣壳由三个主要结构蛋白构成:纤突、六邻体和五邻体,其感染性强,形态结构清楚,并且科研用途广泛。目前,犬腺病毒已知血清型是1型和2型,虽然两者之间具有免疫交叉保护作用,但它们在病原性嗜性方面均不相同。这两种血清型腺病毒基因组的同源性在57-70%之间。犬腺病毒感染是犬的病毒性传染病,主要引起犬的肝炎、呼吸道病变及眼睛疾患等,还可引起狼、狐、哺乳动物脑炎。近年来,国内外已证实存在两种相互有关但各具特点的腺病毒:病毒1型(CAV-1)是犬传染性肝炎和狐狸脑炎的病原,且能导致眼睛损伤,而2型(CAV-2)则能引起犬的传染性喉气管炎、幼犬肺炎和肠道症状。CAV-2感染病理变化常表现在呼吸道,表现肺膨胀不全,充血,并伴不同程度的肝变、支气管淋巴结充血,组织学检查可见中度肺炎病变,支气管上皮、隔细胞、鼻甲上皮有核内包涵体。

单克隆抗体技术自问世的30多年来发展迅猛,目前已被成功地用于分子生物学、免疫学等许多领域的研究。在兽医学领域,单克隆抗体对于疾病检测治疗发挥了重要作用。胶体金免疫层析试纸条是快速、准确、特异和灵敏的诊断方法,只需少量样品,且样品不需处理,很短的时间里就能对是否染病做出准确判断,利于养殖单位早隔离、早治疗,符合基层养殖单位对于疾病快速诊断的要求。目前针对CAV-2的单克隆抗体及其诊断胶体金试纸条的研制还没有报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1。

一株分泌CAV-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.10878,保藏日期为2015年5月27日。

本发明的目的之二是提供一株上述杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体。

本发明的目的之三是提供上述杂交瘤细胞株2C1分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体在制备检测CAV-2病原试剂中的应用,具体表现在以下两个方面:

1、与杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原的免疫胶体金试纸条的制备;

2、与杂交瘤细胞株7D7分泌的抗CAV-2病毒单克隆抗体用于检测CAV-2病原夹心ELISA方法的建立。

杂交瘤细胞株7D7,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.10877,保藏日期为2015年5月27日。

本发明将实验室保存的CAV-2病毒接种于MDCK细胞上进行增殖,当80%的细胞出现病变时收获病毒,反复冻融三次,超声30min,12000r/min离心10min,去除细胞碎片及较大的杂质。取上清,4℃,超速28000r/min离心2.5h,取沉淀,用PBS重悬,12000r/min离心10mln,取其上清过非连续蔗糖密度梯度(60%-40%-30%),28000r/min离心2.5h,取其白色部分,加入大量PBS脱糖,28000r/min离心2.5h,取其沉淀,用1.5ml PBS重悬,最终获得CAV-2纯化的病毒。

ELISA方法检测结果表明:纯化的CAV-2病毒能与CAV-2阳性抗体发生特异性反应,表明其具有良好的抗原性。

取适量纯化的病毒与弗氏佐剂1∶1混合乳化,免疫6周龄BALB/C小鼠,按常规方法取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用纯化的病毒作为检测抗原,建立间接EL1SA方法对有融合孔的细胞上清液进行检测筛选阳性细胞克隆株,最终得到两株单一的分泌特异性抗体的杂交瘤细胞克隆株,分别命名为2C1,7D7。

间接免疫荧光结果表明:2C1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能特异性识别CAV-2病毒而与MDCK细胞不反应。

本发明制备的2C1和另一杂交瘤细胞株7D7分泌的两个单克隆抗体的叠加实验结果表明:这两个单克隆抗体为针对CAV-2病毒不同抗原表位的单抗。

本发明的主要优点如下:

1、本发明所制备的单克隆抗体能很好的和CAV-2反应,可用于临床分离毒株的鉴定。

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